SABC(兔IgG)-POD kit

产品内容：

封闭液（5% BSA） 10mL

3% H2O2 10mL

Bio-羊抗兔IgG浓缩液 100μL

SABC-POD浓缩液 100μL

稀释液 30mL

20×DAB显色液A 1mL

20×DAB显色液B 1mL

保存： 如果长时间不使用，请将所有试剂存放于-20℃，如经常使用，可将封闭液、3% H2O2和20×DAB显色液B存放于2-8℃以方便使用。

产品说明：    本试剂盒适合于一抗为兔IgG的免疫组化实验，DAB显色。    SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素(StreptAvidin)是一种从链霉菌中提取的蛋白质，同亲和素一样对生物素有极高的亲和力，亲和素是一个碱性蛋白质（PI=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC即StreptAvidin-Biotin Complex，SABC大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物，大量的酶将保证SABC具有很高的敏感性。

操作步骤:（以石蜡切片为例）

1、切片常规脱蜡至水(三次二甲苯，三次乙醇)。

2、3% H2O2室温处理5-10分钟以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。

3、可选步聚：

a、热修复抗原，将切片浸入0.01M柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后PBS（pH 7.2-7.6）洗涤1-2次。

b、酶消化，滴加消化液，37℃放置10分钟，PBS（pH7.2-7.4）洗涤2-3次。

c、跳过此步，直接进入下一步。

4、滴加5% BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体, 免洗。

5、用稀释液将一抗按一定比例稀释（稀释后的一抗4℃可保存一周），也可另行购买抗体稀释液。滴加稀释的一抗37℃ 孵育1小时左右或20℃ 孵育2小时左右，也可4℃过夜。PBS（pH7.2-7.4）洗涤3次，每次2分钟（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间）。

6、根据用量，用稀释液将Bio-羊抗兔IgG浓缩液按1:50-100稀释成工作液(1mL稀释液加入10-20μL Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液混匀，此工作液4℃可保存一周)。 滴加Bio-羊抗兔IgG工作液， 20-37℃孵育30分钟。PBS（pH7.2-7.4）洗涤3次，每次2分钟。

7、根据使用量，用稀释液将SABC-POD浓缩液按1:100稀释成工作液(1mL稀释液加入10μL SABC-POD浓缩液混匀，此工作液4℃可保存一周)。滴加SABC-POD工作液，20-37℃孵育30分钟。PBS （pH7.2-7.4）洗涤4次，每次5分钟。

8、DAB显色：根据用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mL PBS加入50μL 20×DAB显色液A，加入50μL 20×DAB显色液B 。充分混匀后滴加到切片上，室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-30分钟之间。蒸馏水洗涤终止反应。

9、苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。  对于细胞爬片，固定后，PBS漂洗两次，再用0.5% Triton X-100室温孵育20分钟，PBS漂洗两次，3% H2O2处理15分钟；PBS漂洗两次，接上述第4步。对于冰冻切片，固定后，PBS漂洗两次，接上述第二步。

注意事项： 如果染色背景过高，在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗涤切片4次，PBS洗2次，然后DAB显色。