MTX对口腔癌细胞活力的影响
评估MTX对口腔癌细胞增殖、凋亡、集落形成和迁移能力的影响
用不同浓度MTX处理A253和MOC1细胞，进行CCK-8、凋亡流式、PI染色、集落形成和划痕愈合实验。
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甲氨蝶呤触发的铁死亡通过磷酸化KEAP1介导的NRF2降解抑制SLC7A11/GPX4信号通路，从而抑制口腔癌进展
Methotrexate-triggered ferroptosis suppresses oral cancer progression by phosphorylated KEAP1-mediated NRF2 degradation to inhibit SLC7A11/GPX4 signaling pathway.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、铁死亡特征检测、机制验证（过表达/敲低/突变）及小鼠体内异种移植瘤模型，功能与机制验证完整。
主要模型
A253人口腔鳞癌细胞系 MOC1小鼠口腔鳞癌细胞系 MOC1细胞C57BL/6小鼠异种移植瘤模型
重点核对
MTX处理浓度：1、2、5、10、15 µM 铁死亡抑制剂Fer-1浓度为10 µM CHX浓度为50 µg/mL，MG132浓度为10 µM 体内实验中MTX给药剂量为5 mg/kg A253和MOC1细胞培养条件及培养基配方（McCoy's 5a、IMDM/F-12等）
摘要
背景：口腔癌（OC）是头颈癌中最常见的类型，死亡率高，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。药物诱导的铁死亡是一种新型的非凋亡性细胞死亡形式，为癌症治疗提供了有前景的策略。越来越多的证据强调了甲氨蝶呤（MTX）在多种恶性肿瘤治疗中的重要作用；然而，其在口腔癌铁死亡通路中的作用及其潜在机制仍知之甚少。方法：用MTX处理口腔癌细胞后，进行了多项细胞功能检测，包括细胞增殖、凋亡、集落形成和划痕愈合实验。检测了铁死亡的典型特征，并通过qPCR和蛋白印迹（WB）实验验证了MTX处理细胞中铁死亡通路相关基因和蛋白的表达。通过体外实验进一步探讨了MTX调控口腔癌细胞中核因子E2相关因子2（NRF2）稳定性的机制。最后，在使用MOC1细胞的小鼠模型中，进行了一些实验以证明MTX诱导的铁死亡和肿瘤抑制。结果：在本研究中，基于体外和体内实验，我们发现MTX通过诱导铁死亡显著降低口腔癌细胞活力。机制上，MTX给药通过激活ERK/MAPK信号通路增加了Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）在苏氨酸43位点的磷酸化，从而维持KEAP1与NRF2形成的蛋白复合物。由于NRF2表达降低，MTX处理的口腔癌细胞中SLC7A11和GPX4蛋白水平显著抑制，最终导致口腔癌细胞铁死亡。结论：我们的数据表明，MTX介导的ERK/KEAP1信号通路激活通过抑制NRF2/HO-1/SLC7A11/GPX4轴显著诱导铁死亡，从而抑制口腔癌进展。这些发现表明MTX是口腔癌治疗的有前景的候选药物，提供了有意义且有效的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MTX通过何种机制抑制口腔癌进展，其是否通过诱导铁死亡发挥作用？
- 核心机制
- MTX通过激活ERK/MAPK信号通路，增加KEAP1在苏氨酸43位点的磷酸化，增强KEAP1与NRF2的相互作用，促进NRF2泛素化降解，进而抑制HO-1、SLC7A11和GPX4表达，导致铁死亡。
- 主要证据
- 体外实验显示MTX诱导铁死亡特征（ROS、LPO、MDA、Fe2+升高，GSH降低），敲低或过表达NRF2及SLC7A11可调节MTX效应；体内MOC1移植瘤模型证实MTX抑制肿瘤生长且Fer-1可逆转。
- 研究意义
- MTX作为口腔癌治疗的潜在候选药物，通过调控铁死亡提供一种有意义且有效的治疗策略，并可能与其他治疗药物联合应用以提高抗癌效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定MTX诱导的细胞死亡类型为铁死亡
探索MTX细胞毒性的死亡途径是否依赖铁死亡
使用多种细胞死亡抑制剂（Fer-1、zVAD、3-MA、BAY、NSA）共处理，检测细胞活力；检测铁死亡相关基因和蛋白表达、ROS、LPO、MDA、Fe2+、GSH及线粒体形态。
验证SLC7A11和GPX4在MTX诱导铁死亡中的作用
确定MTX是否通过下调SLC7A11和GPX4来诱导铁死亡
检测MTX处理后SLC7A11和GPX4蛋白表达及半胱氨酸摄取和谷氨酸积累；在SLC7A11过表达细胞中检测MTX对细胞活力、凋亡、ROS和LPO的影响。
验证NRF2/HO-1信号通路介导MTX对SLC7A11/GPX4的抑制
探讨MTX是否通过抑制NRF2表达来下调SLC7A11和GPX4
通过RNA-seq分析差异基因，WB检测NRF2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白；利用siRNA敲低NRF2、过表达NRF2、使用NRF2抑制剂ML385和激动剂TBHQ，检测相关蛋白和细胞活力、铁死亡指标。
检测MTX对NRF2蛋白稳定性和泛素化的影响
探究MTX是否通过泛素-蛋白酶体途径降解NRF2
使用CHX和MG132处理，检测NRF2蛋白半衰期；用IP检测NRF2泛素化水平及KEAP1-NRF2相互作用。
验证KEAP1磷酸化增强与NRF2的相互作用
确定MTX是否通过增加KEAP1磷酸化来促进NRF2降解
检测KEAP1和NRF2的磷酸化/乙酰化修饰；在KEAP1敲除细胞中过表达KEAP1野生型或T43D/T43A突变体，检测NRF2水平和相互作用。
验证ERK/MAPK在MTX诱导KEAP1磷酸化中的作用
探讨MTX是否通过激活ERK信号通路促进KEAP1磷酸化
检测MTX处理后MAPK通路蛋白磷酸化水平；通过siRNA敲低ERK、使用ERK抑制剂SCH772984和激活剂C16-PAF，检测下游蛋白和细胞活力。
体内验证MTX的抗肿瘤作用
验证MTX在体内是否通过铁死亡抑制口腔癌生长
利用MOC1细胞建立C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，给予MTX或联合Fer-1，监测肿瘤生长，检测铁死亡指标、蛋白表达和免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5a培养基 | -- | -- |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| F-12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 甲氨蝶呤 | MedChemExpress (MCE) | HY-14519 |
| 细胞处理 | Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 |
| Z-VAD-FMK | MCE | HY-16658B | |
| 3-甲基腺嘌呤 | MCE | HY-19312 | |
| BAY 11-7082 | MCE | HY-13453 | |
| Necrosulfonamide | MCE | HY-100573 | |
| 铁死亡检测 | H2DCFDA | MCE | HY-D0940 |
| BODIPY 581/591 C11 | MCE | HY-D1301 | |
| 蛋白稳定性检测 | MG132 | MCE | HY-13259 |
| 细胞处理 | SCH772984 | MCE | HY-50846 |
| C16-PAF | MCE | HY-108635 | |
| 细胞凋亡检测 | 碘化丙啶 | MCE | HY-D0815 |
| 细胞处理 | ML385 | MCE | HY-100523 |
| TBHQ | MCE | HY-100489 | |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Vazyme | R401-01 |
| qPCR | HiScript II Q RT superMix | Vazyme | R223-01 |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | Vazyme | A311-01 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Vazyme | PB101-01 |
| 凋亡检测 | PE-Annexin V/7AAD凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A213-01 |
| 集落形成实验 | 结晶紫染色液 | Beyotime | C0121-100 ml |
| 铁死亡检测 | GSH检测试剂盒 | Beyotime | S0053 |
| MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131S | |
| Western blot | HRP标记山羊抗兔IgG(H+L) | Beyotime | A0208 |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L) | Beyotime | A0216 | |
| 免疫荧光 | Alexa fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L) | Beyotime | A0468 |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime | P0131-5 ml | |
| 铁死亡检测 | 亚铁离子比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K773-M |
| 胱氨酸摄取荧光检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-F066 | |
| 脂质过氧化(4-HNE)检测 | Abcam | ab238538 | |
| 谷氨酸检测 | Abcam | ab83389 | |
| Western blot | 抗GPX4抗体 | Abcam | ab125066 |
| 抗磷酸化(Ser/Thr)抗体 | Abcam | ab117253 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | Abcam | ab190479 | |
| 抗Nrf2(磷酸化S40)抗体 | Abcam | ab76026 | |
| 抗泛素抗体 | Abcam | ab134953 | |
| 抗SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP | |
| 抗ACSL4抗体 | Proteintech | 22401-1-AP | |
| 抗FSP1抗体 | Proteintech | 20886-1-AP | |
| 抗ACSL3抗体 | Proteintech | 20710-1-AP | |
| 抗CD98抗体 | Proteintech | 15193-1-AP | |
| 抗NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 抗KEAP1抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| 抗HO-1抗体 | Proteintech | 10701-1-AP | |
| 免疫沉淀对照 | 抗IgG抗体 | Proteintech | 30000-0-AP |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP |
| 抗CD71抗体 | Cell Signaling Technology | 13113 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗p-ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗P38抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗p-P38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗p-JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | 12202 |
| Western blot | 4-羟基壬烯醛(4-HNE)抗体 | MCE | HY-P8120 |
| 免疫组化 | SABC(兔IgG)-POD试剂盒 | Solarbio | SA0021 |
| 铁染色 | 普鲁士蓝铁染色试剂盒(含核固红) | Solarbio | G1422 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞活力检测 | 酶标仪 | BioTEK Instruments, Inc. | -- |
| 流式分析 | 流式细胞仪(CytoFLEX) | -- | -- |
| 显微镜 | 光学显微镜 | Nikon | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Nikon | -- |
| 细胞系 | A253细胞系(OSCC, CL-0860) | Wuhan Pricella Biotechnology Co., Ltd | CL-0860 |
| MOC1细胞系(OSCC, YS1070C) | Yaji Biological | YS1070C |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | A253细胞使用McCoy's 5a培养基，MOC1细胞使用IMDM:F-12=2:1培养基，均添加10% FBS和1%青霉素/链霉素，MOC1还添加40 µg/mL氢化可的松、5 µg/mL EGF和5 mg/mL胰岛素；培养条件37℃、5% CO2 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and cell culture |
| MTX处理 | MTX浓度：1、2、5、10、15 µM；溶解于DMSO配制10 mM储存液，-20℃保存 阅读提示：Materials and methods - Antibodies and reagents, Cell viability assay |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度：2×10^3细胞/孔（96孔板）；MTX处理时间：24 h、48 h；CCK-8孵育2 h，450 nm检测 阅读提示：Materials and methods - Cell viability assay, Results - Fig. 1B-C |
| 凋亡检测 | 细胞接种密度：1×10^5细胞/孔（6孔板）；MTX处理24 h；PE-Annexin V/7AAD染色，流式检测 阅读提示：Materials and methods - Cell viability assay, Results - Fig. 1D-E |
| 集落形成实验 | 细胞接种密度：1×10^3细胞/孔（6孔板）；MTX处理24 h，然后继续培养14天；4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色 阅读提示：Materials and methods - Cell viability assay, Results - Fig. 1G-H |
| 划痕愈合实验 | 细胞接种密度：1×10^5细胞/孔（6孔板）；MTX处理24 h后划痕，用1% FBS培养基培养，0、24、48 h观察 阅读提示：Materials and methods - Cell viability assay, Results - Fig. 1I-J |
| 铁死亡抑制剂实验 | MTX浓度5 µM；抑制剂浓度：Fer-1 10 µM、zVAD 10 µM、3-MA 5 mM、BAY 10 µM、NSA 5 µM；共处理24 h 阅读提示：Materials and methods - Cell viability assay, Results - Fig. 2A-B |
| ROS和LPO检测 | MTX处理24 h；H2DCFDA 2 µM或BODIPY 581/591 C11 5 µM孵育30 min，流式检测 阅读提示：Materials and methods - Detection of ROS and lipid peroxidation, Results - Fig. 2E-H |
| MDA、Fe2+、GSH检测 | MTX处理48 h；使用相应试剂盒检测细胞裂解液 阅读提示：Materials and methods - MDA, Fe2+, 4-HNE, GSH and LDH assays |
| 蛋白稳定性实验 | CHX 50 µg/mL，MTX 5 µM；MG132 10 µM预处理4 h，MTX处理24 h 阅读提示：Materials and methods - Degradation of the NRF2 assay, Results - Fig. 5B-C |
| 免疫共沉淀 | 使用蛋白A/G磁珠富集复合物，IP抗体包括NRF2、KEAP1 阅读提示：Materials and methods - Western blot (WB) and Immunoprecipitation (IP) assays |
| 体内实验 | 6周龄雌性C57BL/6小鼠，每组6只；MOC1皮下接种；肿瘤体积达100 mm³时随机分组；MTX剂量5 mg/kg；肿瘤直径每3天测量；Fer-1剂量文中未明确说明 阅读提示：Materials and methods - Tumor xenografts, Results - Fig. 7A-E |