单自发光 + IF3标扫描 单外源自发荧光联合 IF重标记

一、服务简介

技术痛点与方案原理

二、服务核心优势

1. 前置离体组织荧光成像，成像结果和活体成像数据匹配一致，可开展荧光灰度定性定量双重分析，快速判定动物造模是否成功；
2. 首轮全景扫描完整留存单组标记自发荧光原始信号，大幅降低后续多轮蛋白标记流程中的荧光淬灭风险；
3. 配套专用荧光淬灭设备彻底清除切片背景与残留标记荧光，提升抗体标记特异性；搭配 TSA 信号放大体系，检测灵敏度高，同源、异源各类抗体均可适配；
4. 融合程序以 DAPI 通道为对齐基准，采用 0.5 像素高精度重合算法匹配所有轮次扫描图像，融合图像完整、对位无偏移；
5. 配套轻量化图像浏览分析工具，普通办公电脑即可读取全景文件，一键输出共定位细胞数量、阳性比率、阳性面积、细胞密度等量化参数，无需高端服务器硬件。

三、完整标准实验流程

前置样本与自发荧光采集流程

1. 构建荧光标记动物模型，完成活体成像验证；
2. 组织取材，纱布吸干表面水分，液氮速冻 15s，置于 - 80℃避光保存；
3. 组织短时间固定（24h 以内），荧光成像设备采集离体组织荧光图像，完成灰度定量检测；
4. 制备冰冻切片，DAPI 复染封片，全景扫描完整留存单组标记自发荧光原始成像。

三种靶蛋白多轮免疫荧光操作流程

1. 去除切片盖玻片；
2. 抗原修复处理；
3. 荧光淬灭设备清除切片标记自发荧光与组织背景自发荧光；
4. 内源性过氧化物酶封闭；
5. 血清封闭；
6. 第一种一抗孵育；
7. HRP 标记二抗孵育；
8. iF488-TSA 荧光标记；
9. 抗体洗脱液洗脱本轮一抗、二抗；
10. 循环执行血清封闭、一抗孵育、HRP 二抗、TSA 标记、抗体洗脱整套流程，依次完成第二、第三种靶蛋白染色；每轮染色后均执行 DAPI 复染、封片、全景扫描、清除荧光基团操作；
11. DAPI 复染细胞核并封片，多通道高清全景扫描；
12. 去除盖玻片，抗体洗脱液清洗切片；
13. 专用设备彻底清除切片残留荧光基团；
14. 软件对单组自发荧光、三种靶蛋白全部扫描图像开展高精度融合；
15. 对融合图像开展共定位、阳性率、阳性面积等量化数据分析。

四、样本保存与运输规范

五、样本送检注意事项

1. 送检时需完整备注标记自发荧光的类型、激发波长与发射波长；成像设备设有固定滤光波段，荧光波长不在区间内无法完成成像；
2. 切片前组织仅可短时间固定（24h 内），固定后的样本不能开展其他分子实验；如需多种检测，需提前分切分装组织；
3. 若标记荧光药物可溶于水或有机试剂，需提前告知，防止固定溶解荧光物质导致实验失败；
4. 脑、脊髓等神经系统样本，后续检测 IBA-1 蛋白时，取材后立即固定，3 日内送检；固定不足会造成抗体标记失败，固定过久会产生背景荧光干扰自发荧光观测。

六、交付成果