免疫荧光单标记和双标记的方法
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免疫荧光单标记和双标记的方法
1免疫荧光单标记方法
1)所需材料与试剂
(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。
(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。
(4)封闭液。
(5)0．01mol／LPBS缓冲液。
2)染色方法
(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass―bottom培养皿，用0．01MPBS洗2―3遍。
(2)加入0．3％的TritonX―100，37℃，30rain。
(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。
(6)0．3％TritonX―100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗，37℃，孵育1h。
(8)0．3％TritonX―100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。
(9)90％甘油(PBS配制)封片。
(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2．免疫荧光双标记方法
免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。
其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠，且尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下，染色时两种一抗可以同时孵育，然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。
3．样品制备注意事项
(1)在进行免疫荧光标记时，如样品的来源为组织，应采用冷冻切片。
(2)样品制备应满足一般荧光显微镜观察的要求。
(3)尽量去除非特异性荧光信号。细胞经荧光染色后可能会产生自发荧光，可用PBS取代一抗作为对照，以区分自发荧光和阳性结果。
(4)为了不将细胞压扁，盖玻片与载玻片之间的介质多用甘油与PBS混合液(9：1)封片，甘油还有抗荧光淬灭的作用。同时还应注意封片时避免产生气泡。
(5)用指甲油将盖玻片四周封片，注意避免将细胞压扁。
(6)为防止荧光淬灭，可在介质中加入抗氧化剂DABCO(100mg／mi)，室温，密封可保存6个月；或苯二胺(100mg／mi)，-20℃，保存2～3周
