Dual Luciferase Reporter Gene

萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）是一种分子量约为61 kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，能够催化萤光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的过程中会发出波长为560 nm左右的生物萤光。海肾萤光素酶（Renilla luciferase）是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的过程中会发出波长为480nm左右的生物萤光。两种生物萤光都可通过化学发光仪进行测定。检测原理如图所示：

图1：萤火虫和海肾萤光素酶检测原理图

通常将目的基因的5´UTR或启动子克隆至Firefly Luciferase的上游，或3´UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通过检测萤火虫萤光素酶的量来检测启动子或调控元件的转录调控作用。Renilla Luciferase作为内参，来消除细胞数量、转染效率等的差异。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以萤光素为底物来检测萤火虫萤光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该萤光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾萤光素酶报告基因的活性。该试剂盒具有灵敏度高的特点。

裂解能力更强：能够彻底裂解绝大部分种类细胞。

信号更强：能够精准检测弱启动子的表达。

线性范围更广：线性检测范围超过酶浓度的8个数量级。

1、产品性能和进口产品一致

图1展示了萤火虫萤光素酶发光强度、淬灭效果以及海肾萤光素酶发光强度的对比情况。翌圣11402双荧光素酶报告基因检测产品在发光强度方面与进口品牌P表现相当。同时，在萤火虫萤光素酶的淬灭效果上，翌圣11402同样与进口品牌P不相上下，且显著优于其他国产品牌。此外，翌圣11402的荧光残留量极低，几乎可以忽略不计，这使得其完全不会对海肾萤光素酶的再次发光产生任何影响，从而保证了实验结果的准确性和可靠性。

2、信号更加稳定

图2 翌圣11402双荧光素酶报告基因检测产品Firefly luciferase萤光信号稳定性（动力学）检测结果显示，从反应初始时刻起持续追踪Firefly luciferase萤光信号长达30分钟，发现翌圣11402的萤光信号几乎无衰减，信号稳定性表现出色，远超常规机器操作所需时长，能够充分满足实际检测需求。

3、冻融5次对产品信号基本无影响

图3 翌圣11402双荧光素酶报告基因检测产品在经过5次反复冻融处理后，检测其Firefly luciferase和Renilla luciferase萤光信号，结果显示信号强度几乎不受影响，稳定性极高。这一特性使其在实验室环境中更具实用性，能够更好地满足日常使用需求。

干冰运输。 -20℃保存，有效期1年。

萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应工作液现配现用，且不能反复冻融，建议分装-20℃或-80℃分装保存。

Q：细胞裂解之后的裂解液能否在-80℃保存？

A：可保存在-80℃，基本与蛋白的保存方法类似。裂解后的样本可在 -80 ℃保存半年，-20 ℃保存一个月。

Q：双荧光素酶报告基因检测试剂盒中的两个底物是否需要避光的？

A：这两个底物操作过程中不需要严格避光。保存的时候避光保存，更重要的保存条件是低温，尤其是腔肠素，推荐-80℃保存。

Q：双荧光素酶报告基因载体共转染时比例该如何进行优化与调整？

A：比例：根据具体实验情况进行调整。建议做预实验：如海参载体与萤火虫载体比例分别用 1:10、1:20、1:50、1:100。萤火虫荧光素酶检测发光值大于海参荧光素酶发光值的比例比较好。

Q：海肾和萤火虫是在同一个孔里面检测吗？萤火虫的萤光不会影响海肾的萤光吗？能否分开检测呢？

A:同一个孔里检测。不会相互影响，我们的海肾荧光素酶底物中有淬灭萤火虫荧光值的物质。可以分开检测，但是在一个孔里检测会更加准确。

Q：使用的是promega的仪器进行检测，发现海肾的本底值偏高很多，是为什么呢？

A：我们的产品与promega的仪器不适配，会导致本底值偏高。建议使用酶标仪检测。

Q:检测萤火虫荧光素酶，酶标仪使用什么样的板子呢？

A：白色不透明的酶标板。

Q：裂解液不够用了，怎么办呢？

A：10ml PBS里加入0.3ml Triton。

Q：如遇使用细胞裂解液对细胞样本裂解后，后续使用BCA方法检测蛋白存在背景较高的情况该如何处理？

A：对细胞裂解样本进行5倍稀释后再检测。

Q: 为啥11402试剂盒里要裂解细胞，40901这个单独的底物不需要？

A: 1、荧光素酶是表达在细胞内，是一种不存在于人类物种的水解酶（所以本底很低），它不能透膜。荧光素酶的底物是环状小分子，是疏水的，因而可以透膜的，因此只要存在荧光素酶表达，那必然是外源的，那么将底物加到细胞培养基中或打到体内均能得到信号。

2、报告基因体外检测需要细胞裂解是为了避免细胞转染异质性、底物渗透不均匀和信号不均一而强行匀质化的做法。体外报告基因检测是一个定量且灵敏度很高的实验，报告基因检测需要ATP和氧气的存在，裂解细胞是需要把表达的荧光素酶完全释放出来，能够有更好的反应，因为细胞内的氧气含量有限，如果不裂解，会导致信号一定程度的降低（有的裂解液也做了一些优化，比如额外加了ATP以提高信号等）。因此报告基因体外检测裂解细胞能够有更好的信号；

3、活体成像，检测仪器功率大，能够透过皮肤，细胞，有更强的穿透力，因此可以不用裂解细胞就可以检测到很强的荧光信号，还有就是活体成像检测比较糙，精准度都是相对的。

Q：当海肾作为主报告基因时检测的顺序是否可以调整呢？

A：不可以调整。在该检测试剂盒中，其中组分B萤火虫萤光素酶缓冲液无论对于萤火虫荧光素酶还是海肾荧光素酶的检测都至关重要，海肾萤光素酶的最适反应环境需要有组分B的存在，否则会出现海肾荧光素酶检测值非常低的情况。

当仅需要检测海肾荧光素酶时，也需要加入组分B，这样才能保证最适反应环境检测到正确的结果。