评估绝经后和OVX后肌肉脂肪浸润及FAPs特性
确定雌激素缺乏对肌肉脂肪浸润和FAPs成脂能力的影响。
收集绝经前后女性及OVX小鼠的肩胛上肌样本，通过免疫荧光染色检测PLIN1、甘油三酯定量评估脂肪浸润；分离FAPs，通过RT-qPCR、Western blot检测ESR1、METTL3表达及成脂基因表达。
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雌激素通过重新激活METTL3-ESR1介导的环抑制绝经后女性纤维/脂肪祖细胞的脂肪生成
Oestrogen suppresses the adipogenesis of fibro/adipogenic progenitors through reactivating the METTL3-ESR1-mediated loop in post-menopausal females.
实验完整度
高包含人样本和OVX小鼠模型，涉及RNA-seq、MeRIP-qPCR、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、蛋白稳定性及体内功能验证等多个证据层级。
主要模型
人肩胛上肌FAPs（绝经前后女性） 小鼠原代FAPs（OVX、Mettl3 KO、Esr1 KO模型） OVX小鼠去卵巢模型
重点核对
人FAPs分离：CD31-/CD45-/CD56-/CD34+；小鼠FAPs分离：CD45-/CD31-/PDGFRα+ OVX模型：8周龄雌性C57BL/6J小鼠双背外侧切口去除卵巢 雌激素处理：每日皮下注射1 µg 17-β-雌二醇-3-苯甲酸酯（Sigma-Aldrich, cat#E8515） FAPs体外成脂分化：ADM诱导10天 Mettl3 KO和Esr1 KO小鼠：Pdgfrα-CreERT2小鼠腹腔注射他莫昔芬（ABCONE, cat#T56488）诱导
摘要
绝经后女性过度的肌肉脂肪浸润源于雌激素缺乏导致的纤维/脂肪祖细胞（FAPs）中甲基转移酶样3（METTL3）–雌激素受体1（ESR1）介导的环的破坏。通过雌激素重新激活METTL3–ESR1介导的环可减轻FAPs的过度脂肪生成，从而改善去卵巢（OVX）小鼠的肌肉脂肪浸润和运动功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 绝经后女性肌肉脂肪浸润过度的具体机制尚不清楚，本研究旨在探究其机制。
- 核心机制
- METTL3介导的m6A修饰通过稳定ESR1 mRNA促进ESR1表达，ESR1作为转录因子增强METTL3转录，同时抑制脂肪生成转录因子PPARγ的转录，从而抑制FAPs的脂肪生成。
- 主要证据
- 人样本和OVX小鼠中FAPs的ESR1/METTL3表达降低、成脂能力增强；MeRIP-qPCR和双荧光素酶报告基因验证了METTL3对ESR1 mRNA的m6A修饰；ChIP-qPCR验证了ESR1与PPARγ和METTL3启动子的结合；E2补充改善了OVX小鼠的肌肉脂肪浸润和运动功能。
- 研究意义
- 通过雌激素重新激活METTL3-ESR1介导的环可能作为抑制绝经后女性FAPs过度脂肪生成、改善肌肉脂肪浸润和运动功能的新型干预措施。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证METTL3通过m6A修饰调控ESR1表达
探究METTL3介导的m6A修饰是否调控ESR1 mRNA稳定性。
利用Mettl3 KO小鼠FAPs，通过MeRIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、RNA稳定性实验验证m6A修饰位点及对ESR1 mRNA稳定性的影响。
验证ESR1对FAPs成脂分化的抑制作用
确定ESR1是否抑制FAPs的成脂分化。
在人和小鼠FAPs中，使用ESR1激动剂PPT、抑制剂MPP和雌激素E2处理，进行油红O染色和成脂基因表达检测；利用Esr1 KO小鼠FAPs验证。
验证ESR1调控PPARγ和METTL3转录的机制
探究ESR1作为转录因子是否直接调控PPARγ和METTL3的转录。
通过JASPAR预测结合位点，构建野生型和突变型启动子荧光素酶报告基因，进行双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证ESR1与PPARγ和METTL3启动子的结合。
验证E2重新激活METTL3-ESR1环并改善体内功能
评估E2补充是否通过激活METTL3-ESR1环减轻肌肉脂肪浸润并改善OVX小鼠的运动功能。
OVX小鼠每日皮下注射E2（17-β-雌二醇-3-苯甲酸酯）或芝麻油对照，通过免疫荧光、甘油三酯定量、步态分析和跑步机测试评估效果，并检测FAPs中METTL3、ESR1表达和m6A水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 他莫昔芬诱导基因敲除 | 他莫昔芬 | ABCONE | T56488 |
| 雌激素处理 | 17-β-雌二醇-3-苯甲酸酯 | Sigma-Aldrich | E8515 |
| 血清雌二醇检测 | 雌二醇ELISA试剂盒 | Beyotime | PE223 |
| FAPs分离 | 胶原酶II | Worthington Biochemical | LS004177 |
| 分散酶II | Life Technologies | 17105-041 | |
| 40 µm细胞筛网 | BD Falcon | 352340 | |
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Cellgro | 10-022-CV |
| 胎牛血清 | Yeasen | 40131ES76 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 药物处理 | 17β-雌二醇 | MCE | HY-B0141 |
| 丙基吡唑三醇 | MCE | 263717-53-9 | |
| 免疫组织学 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | ST023 | |
| 免疫荧光 | Laminin抗体 | Abcam | ab44941 |
| PDGFRα抗体 | Abcam | ab203491 | |
| PPARγ抗体 | Abcam | ab178860 | |
| Perilipin A/B抗体 | Millipore | P1873 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 抗淬灭剂 | Vector Laboratories | H-100 | |
| 油红O染色 | 油红O | Solarbio | G1260 |
| 甘油三酯定量 | 甘油三酯定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K261-M |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-018 |
| MuLV逆转录酶 | NEB | M0253L | |
| SYBR Green qPCR预混液 | ABclonal | RK21203 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | P1008 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1082 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010S |
| 蛋白质印迹 | 上样缓冲液 | Yeasen | 20315ES05 |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ESR1抗体 | Abcam | ab32063 | |
| METTL3抗体 | Abcam | ab195352 | |
| PPARγ抗体 | Proteintech | 66936-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | CST | 2118L | |
| 二抗 | Santa Cruz | sc-2005 | |
| 二抗 | Santa Cruz | sc-2357 | |
| 快速抗体剥离缓冲液 | Epizyme | PS107 | |
| 基因过表达 | pAdTrack-CMV腺病毒载体 | Addgene | 16405 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | 11668019 | |
| m6A dot blot | 抗m6A抗体 | Abcam | 151230 |
| MeRIP | m6A RNA富集试剂盒 | Epigentek | P-9018-48 |
| MeRIP-seq | 链特异性mRNA-seq试剂盒 | Illumina | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO载体 | MIAOLING BIOLOGY | P0198 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | YEASEN | 11402ES60 | |
| pGL3-basic荧光素酶报告基因载体 | Promega | -- | |
| pCMV-ESR1表达载体 | MIAOLING BIOLOGY | P58644 | |
| 低血清培养基 | Thermo Fisher | 31985062 | |
| ChIP-qPCR | SimpleChIP Plus试剂盒 | CST | 9005S |
| 兔IgG | CST | 2729 | |
| RNA-seq | RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7530L |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人样本收集 | 绝经后女性标准：连续12个月无月经且无干预；围绝经期分组依据STRAW+10标准；样本来源：肩关节置换或肩部创伤患者 阅读提示：Methods 2.1 Human sample |
| OVX模型构建 | 8周龄雌性C57BL/6J小鼠；双背外侧切口；OVX后12周和18周分析 阅读提示：Methods 2.2 Animals |
| FAPs分离与鉴定 | 小鼠FAPs：CD45-/CD31-/PDGFRα+；人FAPs：CD31-/CD45-/CD56-/CD34+；流式细胞术分选 阅读提示：Methods 2.4 Isolation of muscle FAPs |
| FAPs培养与成脂分化 | 生长培养基：α-MEM+20% FBS+1%青霉素-链霉素；成脂诱导10天；E2浓度100 nM，PPT 50 µM，MPP 10 µM 阅读提示：Methods 2.5 Cell culture, adipogenic differentiation and treatment |
| 体内雌激素治疗 | 每日皮下注射150 µL 18 µM 17-β-雌二醇-3-苯甲酸酯；对照：150 µL芝麻油；OVX小鼠8周龄开始处理 阅读提示：Methods 2.2 Animals 和 Results 3.7 |