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- 2026年01月04日
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- 文献和实验
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- 提供商：
上海达为科生物科技有限公司
- 服务名称：
阳性克隆
1. 基本定义
阳性克隆指含有目标重组DNA或特定蛋白的细胞/噬菌体克隆。例如：
- 基因工程中，携带外源目的基因的克隆称为阳性克隆子（期望重组子）。
- 抗体开发中，能分泌目标抗体的杂交瘤细胞或重组噬菌体即为阳性克隆。
2. 鉴定方法与标准
不同实验采用特异性检测手段：
- 分子检测：
- PCR/酶切验证：克隆中扩增出目标片段（如1700bp的插入片段）或酶切后出现预期条带。
- 测序确认：通过序列比对确认外源基因正确插入。
- 蛋白结合活性检测：
- ELISA筛选：以P/N值（阳性/阴性OD450比值）>2.1为标准，或OD450值大于对照2倍。例如，抗PD-1抗体筛选要求OD450值 > Sp2/0细胞上清的2倍；抗Bt Cry1C抗体的阳性克隆P/N值需>2.1。
- 噬菌体展示技术：通过多轮"panning"富集高亲和力克隆，每轮富集倍数达10²–10³。
3. 阳性克隆率的影响因素
- 载体与感受态细胞：载体量为200ng、使用Stbl3感受态细胞时，阳性克隆率最高达75%。
- 技术平台差异：
- ZooMAb®重组抗体平台阳性克隆率80-90%，远高于杂交瘤技术（<1%）。
- 噬菌体文库筛选的阳性率随抗原浓度升高而增加（0.5μg抗原时阳性率达58.3%）。
4. 筛选流程优化
- 基因编辑（CRISPR/Cas9）：
- 混合克隆预筛（Pool验证）可快速评估突变效率。
- Cruiser™酶可在20分钟内精准切割突变位点，通过电泳直观鉴定阳性克隆。
- 单克隆扩增：采用有限稀释法确保单细胞来源，经3-5轮亚克隆获得稳定株系。
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文献和实验阳性克隆筛选方法汇总 ——基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法 近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。 关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步。 一，混合克隆pool验证 质粒转染后48-72小时
近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷，尤其是CRISPR/Cas9，一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时，各大公司也开发出一系列相应的产品，其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。 目前，市面上只有Genloci的Cruiser™、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法，被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而，SURVEYOR是进口产品，价格贵，货期长；T7EI可以识别多种DNA结构，如十字
近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷，尤其是CRISPR/Cas9，一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时，各大公司也开发出一系列相应的产品，其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。目前，市面上只有Genloci的CruiserTM、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法，被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而，SURVEYOR是进口产品，价格贵，货期长；T7EI可以识别多种DNA结构，如十字
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