G418筛选

一、G418的作用机制与特性

1. 分子特性

   • G418（遗传霉素）是一种氨基糖苷类抗生素，分子式为 ，分子量692.71，白色粉末，易溶于水和甲醇。
   • 通过干扰80S核糖体功能阻断蛋白质合成，对原核/真核细胞（细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞）均有毒性。

2. 抗性原理

   • 细胞转染携带 neo 基因（或 nptII 基因）的质粒后，表达 氨基糖苷磷酸转移酶，该酶修饰G418结构使其失活，赋予细胞抗性。
   • 抗性为显性表型，适用于稳定转染细胞株筛选。

二、G418筛选操作流程

（1）前期准备：浓度优化（关键步骤）

• 浓度范围：

  细胞类型	推荐起始浓度	全致死浓度确定范围
  哺乳动物细胞	400 μg/mL	100–1000 μg/mL
  植物细胞	10 μg/mL	10–100 μg/mL
  酵母细胞	500 μg/mL	500–1000 μg/mL

• 杀死曲线（Kill Curve）实验：

  • 设置至少6个浓度梯度，在细胞对数生长期加药。
  • 目标：选择10–14天内杀死全部未转染细胞的最低浓度。
  • 示例：若400 μg/mL可杀死细胞，但800 μg/mL过早致死，需测试500–700 μg/mL梯度。

（2）筛选步骤

1. 转染后处理：
   • 转染含 neo 基因的质粒/病毒后24小时开始加药，避免过早增加细胞代谢负荷。
2. 筛选培养：
   • 使用含G418的筛选培养基，每3–5天更换新鲜药液（因药物活性随代谢下降）。
   • 细胞密度：≤25% 汇合度，确保抗生素效力。
3. 抗性克隆出现：
   • 哺乳动物细胞约14天可见抗性克隆。
4. 单克隆挑选与扩增：
   • 方法1（套环法） ：玻璃套环隔离单个克隆，胰酶消化转移。
   • 方法2（有限稀释法） ：稀释细胞至0.5细胞/孔，96孔板培养。
5. 二次筛选与验证：
   • 初次筛选4周后，需进行第二轮筛选确保基因稳定整合。
   • 验证方法：
     • RT-PCR 检测目的基因。
     • Western Blot 检测蛋白表达（灵敏度1–5 ng）。