通用qPCR染料法预混液（无需调节ROX）

产品简介

2×Universal qPCR Fluore Green Master Mix (No ROX adjustment)是2×实时定量PCR扩增的预溶液，高灵敏度、高特异性，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增；同时添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，可以在较为宽泛的定量区域内获得良好线性关系。

本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需根据不同仪器调整ROX。

产品信息

储存条件

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1. 推荐使用Arcegen一链cDNA合成反转录预混液（Cat#N132061），有效去除RNA样品的残留基因。

2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

4. 本产品仅用于科研。

使用说明

1. 反应体系

【注】使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

1) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

2) 模板浓度：如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

3) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20-30个循环为好。     

4) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

5) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

标准程序                                                      

快速程序

【注】快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

1) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

2) 荧光信号采集（★）：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

3) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

2. 结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确。

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验。

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性。

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

3. 引物设计指南

1) 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3) 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4) 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5) 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6) 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

4. 适用机型

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler;

Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.