真香！用 qPCR 做外泌体研究，南京医科大学拿下 41 分 SCI
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外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡（30～150 nm），它可将源自亲代细胞的特定物质递送至疾病发展相关的受体细胞，因此一直被认为可作为疾病进展的潜在生物标志物用于诊断，但具体机制仍不清楚。
外泌体 RNA 作为癌症诊断标志物是否可行？
CircLPAR1 是外泌体中的环状 RNA 分子，在结直肠癌（CRC）患者血浆外泌体中会发生显著变化。南京医科大学团队在 Molecular cancer 发文[1]，通过对 CRC 特异性的外泌体 circRNA 进行鉴定和富集，最后使用 qPCR 检测后进行功能评估。本研究对血浆外泌体 circLPAR1 可作为 CRC 高灵敏早期诊断标志物提供了新的证据。
qPCR 检测外泌体是强强联手还是无稽之谈？
我们也许会有疑问：外泌体本来就少，提取的 RNA 就更少，后续做 qPCR 检测岂不是难上加难？想知道 qPCR 检测外泌体是否具有合理性，我们需要先了解如何进行这项实验。
实验过程：
1）外泌体提取
包括 Umibio 在内的很多公司都有针对各种不同样本的外泌体提取试剂盒。样本预处理阶段很重要，甚至决定了后续提取外泌体的纯度和量。
2）RNA 提取
外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取，也可以用 Trizol 法提取，建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1（也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀）。
具体操作：取 200 μl 外泌体于 1.5 ml EP 管中，加入 800 μl Trizol 试剂，充分混合，裂解 10 min，12000 rpm 离心 10 min 取上清。
3）反转录
采用 Umibio 4× 预混型快速逆转录试剂盒：适用于长片段 RNA（如 mRNA、LncRNA 等）、miRNA 加尾法逆转录试剂盒做反转录：适用于短片段 RNA（主要为 miRNA）的加尾法。
4）qPCR 检测
采用 Umibio 2×SYBR Green qPCR 试剂：预混 ROX1 型适用于 ABI 5700 等设备、预混 ROX2 型适用于 ABI 7500 等设备。
5）数据分析：采用仪器自带的 QPCR 分析软件进行数据分析
可以看到 qPCR 检测外泌体可行且可靠，但实验过程并不简单，因此我们对经常会遇到的问题及解答也进行了整理，帮助大家更好的完成实验。
qPCR检测外泌常见问题及解决方法
1. 外泌体 RNA 如何提取？
外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取，也可以用 Trizol 法提取，建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1（也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀）。
2. 外泌体 RNA 如何定量？
外泌体 RNA 含量很低，不建议使用微量紫外分光光度计定量，可以使用 Agilent 2100 生物分析仪等定量，也可以直接按最大体积进行逆转录实验。
3. 外泌体做 qPCR 检测应该选什么参照？
外泌体没有通用的内参选择，可以使用外参（cel-miR-39）作为参照。
4. 外泌体多样本进行 qPCR 检测时，扩增曲线和溶解曲线有差异，是否正常？
一般来说属于正常现象，由于外泌体不像细胞或者组织来源稳定，不同外泌体样本及处理的差异，可能导致外泌体里核酸含量及片段大小不同，会产生扩增曲线或溶解曲线的差异。
5. 外泌体 qPCR 检测 CT 值较大是否正常？
属于正常现象，由于外泌体 RNA 含量较低，特别是一些低丰度的基因 CT 值会较大，可以选择高效的反转录及 PCR 试剂。
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