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        真香!用 qPCR 做外泌体研究,南京医科大学拿下 41 分 SCI

        宇玫博生物

        810

        外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡(30~150 nm),它可将源自亲代细胞的特定物质递送至疾病发展相关的受体细胞,因此一直被认为可作为疾病进展的潜在生物标志物用于诊断,但具体机制仍不清楚。

        外泌体 RNA 作为癌症诊断标志物是否可行?

        CircLPAR1 是外泌体中的环状 RNA 分子,在结直肠癌(CRC)患者血浆外泌体中会发生显著变化。南京医科大学团队在 Molecular cancer 发文[1],通过对 CRC 特异性的外泌体 circRNA 进行鉴定和富集,最后使用 qPCR 检测后进行功能评估。本研究对血浆外泌体 circLPAR1 可作为 CRC 高灵敏早期诊断标志物提供了新的证据。

        qPCR 检测外泌体是强强联手还是无稽之谈?

        我们也许会有疑问:外泌体本来就少,提取的 RNA 就更少,后续做 qPCR 检测岂不是难上加难?想知道 qPCR 检测外泌体是否具有合理性,我们需要先了解如何进行这项实验。

        实验过程:

        1)外泌体提取

        包括 Umibio 在内的很多公司都有针对各种不同样本的外泌体提取试剂盒。样本预处理阶段很重要,甚至决定了后续提取外泌体的纯度和量。

        2)RNA 提取

        外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取,也可以用 Trizol 法提取,建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1(也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀)。

        具体操作:取 200 μl 外泌体于 1.5 ml EP 管中,加入 800 μl Trizol 试剂,充分混合,裂解 10 min,12000 rpm 离心 10 min 取上清。

        3)反转录

        采用 Umibio 4× 预混型快速逆转录试剂盒:适用于长片段 RNA(如 mRNA、LncRNA 等)、miRNA 加尾法逆转录试剂盒做反转录:适用于短片段 RNA(主要为 miRNA)的加尾法。

        4)qPCR 检测

        采用 Umibio 2×SYBR Green qPCR 试剂:预混 ROX1 型适用于 ABI 5700 等设备、预混 ROX2 型适用于 ABI 7500 等设备。

        5)数据分析:采用仪器自带的 QPCR 分析软件进行数据分析

        可以看到 qPCR 检测外泌体可行且可靠,但实验过程并不简单,因此我们对经常会遇到的问题及解答也进行了整理,帮助大家更好的完成实验。

        qPCR检测外泌常见问题及解决方法

        1. 外泌体 RNA 如何提取?

        外泌体 RNA 可以用专用的外泌体 RNA 提取试剂盒提取,也可以用 Trizol 法提取,建议 Trizol 与外泌体的体积比不小于 4:1(也可以用 Trizol 直接裂解外泌体沉淀)。

        2. 外泌体 RNA 如何定量?

        外泌体 RNA 含量很低,不建议使用微量紫外分光光度计定量,可以使用 Agilent 2100 生物分析仪等定量,也可以直接按最大体积进行逆转录实验。

        3. 外泌体做 qPCR 检测应该选什么参照?

        外泌体没有通用的内参选择,可以使用外参(cel-miR-39)作为参照。

        4. 外泌体多样本进行 qPCR 检测时,扩增曲线和溶解曲线有差异,是否正常?

        一般来说属于正常现象,由于外泌体不像细胞或者组织来源稳定,不同外泌体样本及处理的差异,可能导致外泌体里核酸含量及片段大小不同,会产生扩增曲线或溶解曲线的差异。

        5. 外泌体 qPCR 检测 CT 值较大是否正常?

        属于正常现象,由于外泌体 RNA 含量较低,特别是一些低丰度的基因 CT 值会较大,可以选择高效的反转录及 PCR 试剂。

         

        文章来源:宇玫博生物

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