免疫荧光五标六色（芯片）

免疫荧光五标六色（芯片）

服务介绍：　

组织芯片的免疫荧光检测，是将许多不同个体组织标本以规则微阵列方式排布于同一载玻片上，同时进行相同指标的免疫荧光检测。组织芯片荧光五标实验是在同一张组织芯片上对五个抗原进行同时标记，从而实现定性，定位，半定量分析。 组织芯片的免疫荧光检测，标本体积小, 标本信息含量大 , 一次性实验即可获大量结果。实验条件更易控制一致，减少批间批内误差，结果更准确。

 

 

 

 

送样运输要求：

1、组织样本放置于10倍样本体积的通用型组织固定液中固定24h以上，常温保存运输石蜡包埋切片。切勿冷冻结冰，切勿固定时间过长。

2、石蜡切片常温保存运输。

3、荧光四标只能做石蜡包埋切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。

实验大体流程：

石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双-氧水封闭——血清封闭——孵育第一种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第二种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第三种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第四种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第五种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF700-TSA——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。

实验具体流程：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ PH 6.0 柠檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐PH 6.0 柠檬酸修复液）。

3、画圈, 双-氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒滴加3%双-氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床晃动洗涤3次，每次5min。

4、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7、加iF440-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF440-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

8、微波处理：组织切片置于盛满PH 6.0 柠檬酸修复液的修复盒中于微波炉内加热处理维持沸腾10min左右去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

10、加第二种一抗：在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

11、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

12、加iF488-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF488-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

13、微波处理：组织切片置于盛满PH 6.0 柠檬酸修复液的修复盒中于微波炉内加热处理维持沸腾10min左右去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

14、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

15、加第三种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

16、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

17、加iF546-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF546-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

18、微波处理：组织切片置于盛满PH 6.0 柠檬酸修复液的修复盒中于微波炉内加热处理维持沸腾10min左右去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

19、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

20、加第四种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

21、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

22、加iF594-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF594-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

23、微波处理：组织切片置于盛满PH 6.0 柠檬酸修复液的修复盒中于微波炉内加热处理维持沸腾10min左右去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

24、血清封闭:切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

25、加第五种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

26、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

27、加iF700-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF700-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

28、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

29、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

30、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

31、镜检成像：切片置于玻片数字扫描仪下扫描全景成像。