免疫荧光

实验概念：免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光通过抗体与示踪物质结合，利用抗原-抗体结合反应，进而对抗原所在的细胞或组织进行定性或定量。

实验中心：

江苏瀚江生物

实验步骤：

1、细胞爬片

用镊子夹住拨片的一角，在火上烘烤后，置于6孔板中，先加入少许细胞完全培养基(防止拨片在加入细胞悬液后漂浮)，加入合适的细胞密度的细胞悬液，置于 37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h左右使细胞贴壁

 

2、细胞固定

从细胞培养箱中取出已爬好片的孔板，PBS洗涤3次，每次室温静置5 min,吸去剩余的 PBS,每孔中加入 4%多ju甲醛1ml,室温静置 20 min;

 

3、细胞通透处理

吸掉固定液，用PBS洗涤3次，每次静置5min，每孔加入0.5%Triton-100 溶液1ml，室温放置 20 min;(定位在细胞膜上的蛋白，这步省略)

4、封闭

吸掉孔板中的0.5%Triton-100溶液，PBS洗涤3次，每次静置5min,吸掉PIS，每孔中加入1m1%BSA封闭液封闭，室温封闭30min;

5、一抗处理

吸掉孔板中的封闭液，用1%BSA稀释相对应得一抗，可取出玻片(含有细胞面朝上)，加入一抗，覆盖玻片表面(注意不要加多，利用液体的张力使一抗液体不溢出玻片外)，将玻片放入湿盒中，4℃过夜;

 

6、二抗处理

从湿盒中取出玻片置于6孔板中，用P3ST洗涤3次，每次静置5min，用1%BSA稀释对应种属的二抗。加入二抗，盖玻片表面(注意不要加多,利用液体的张力使一抗液体不溢出玻片外),将玻片放入湿盒中,37℃孵育30min;(加入二抗起，所有操作均需避光)

7、核复染

将玻片咒于6孔板中，用PBST洗涤3次，每次静置5min，加入DAPI染液，空温避光孵育5~10min;
观察拍照:用PBST洗涤3次，每次静置5min，每孔加入PBS，尽快用荧光8、显微镜观察拍照。

注:1%BSA用PBS配制:PBST:0.02%Twecn-20加入到PBS中。