检测实验丨Transwell侵袭实验

Transwell侵袭实验

Transwell侵袭实验是细胞生物学和分子生物学领域广泛应用的实验技术，专门用于深入研究肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力。该实验通过模拟细胞在生理环境中的迁移过程，评估细胞在穿越多孔屏障时的迁移和侵袭能力。Transwell实验不仅有助于理解肿瘤细胞的转移机制，还可用于评估药物对细胞迁移和侵袭能力的影响。

一、原理：

Transwell侵袭实验的基本原理是用一层聚碳酸酯膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞接种到低营养的培养液里。通常，膜孔被Matrigel覆盖，模仿细胞在体内的生理环境。肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有Matrigel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

二、材料与仪器：

实验试剂：

细胞培养基、PBS、固定液、结晶紫染液、基质胶、胰酶、血清白蛋白、DMSO等

实验仪器：

细胞计数仪、离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、移液枪和移液管、4℃和-20℃冰箱、6孔培养板、Transwell小室

三、实验步骤：

1、实验准备

提前将Matrigel基质胶从-20℃放入4℃冰箱过夜，融化成液体状态。

2、包被基底膜

Matrigel基质胶以适当比例（1:8）稀释后，冰上操作包被Transwell小室底部膜的上室面。37℃孵育使Matrigel凝固风干。

3、水化基底膜

吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL无血清培养液，37℃孵育30分钟进行基底膜水化。

4、细胞处理

常规胰酶消化细胞，PBS洗涤1-2遍去除血清。用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×10^5个/mL。

5、接种细胞

取适量细胞悬液加入Transwell小室上室。在24孔培养板下室内加入600μL含10% FBS的完全培养基，作为趋化因子。

6、细胞培养

将培养板置于37℃的CO2培养箱中，依据细胞侵袭能力培养12-48小时。

7、细胞固定与染色

取出小室，PBS淋洗2遍。用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞。在24孔板内用固定液固定20分钟，然后用结晶紫溶液染色15分钟。

8、细胞计数与统计

倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数多个视野，取平均值进行统计分析。

※实验示例：

Transwell侵袭实验

四、注意事项

1、细胞接种剂量

不同细胞的侵袭能力不同，需调整细胞接种数量，确保在收样时上室内仍有一定量的细胞存在。

2、避免气泡

在放置Transwell小室时，注意避免下层培养液和小室间产生气泡，气泡会减弱趋化作用。

3、检测时间点

培养时间主要依癌细胞侵袭能力而定，需根据细胞特性、处理因素等灵活选择。

4、操作细节

用棉签擦掉上室细胞时，注意不要蹭到已穿膜的细胞层。铺胶和加细胞时，注意冰上操作，避免Matrigel提前凝固。

5、饥饿处理

对于较难穿膜的细胞，可以在实验前进行饥饿处理12-24小时，以提高其穿膜能力。