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ssDRIP-seq

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    技术简介

    R-loop是一种特殊的染色体结构,由一条RNA:DNA杂合链和一条单链DNA所组成。目前越来越多的证据发现这种独特的染色质结构在原核和真核生物中普遍存在,在很多关键的生物学过程中发挥重要功能,包括染色质修饰、转录调控、DNA损伤修复以及基因组稳定性等。

    基于单链DNA建库的DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术(简称ssDRIP-seq, single-strand DNA ligation-based library construction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)表现出易操作、精准、高效、高度灵敏、可重复性好等优点,并且可获得DNA链特异性信息。

    实验原理

    首先经过温和的DNA提取和限制性内切酶酶切片段化,然后用S9.6抗体对R环结构进行免疫沉淀实验(该抗体对RNA-DNA杂交物显示出亚纳摩尔亲和力,对双链DNA几乎没有亲和力)。随后将Adp1连接到ssDNA的3 '端,后续生物信息学分析可以根据该接头区分DNA链,且文库构建步骤较少。随后,将Adp2连接到ssDNA的5 '端,进行扩增及测序。这种方法避免了基于随机引物的方法固有的偏差,因为它以序列独立的方式连接接头。

    产品优势

    灵敏度高:能够得到全基因组范围内的R-loop图谱

    特异性好:背景噪音低,所需测序深度少

    链特异性:采用链特异性建库,保留链的信息

    实验重复性好:实验重复结果一致性好

    样品要求

    样品类型

    组织、细胞、总DNA或IP后DNA。其它类型样品请详询。

    样品量

    a) 细胞:2×107

    b) 组织:100 mg

    c) 总DNA:> 30 μg

    样品运输及保存

    样品运输:样品置于1.5mL离心管中,封口膜封好,干冰运输。

    样品保存:细胞样品或新鲜组织块,液氮冻存后-80℃保存;DNA样品-80℃保存,避免反复冻融。

    案例分析

    主题:The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome

    期刊:Nature Plants         发表日期:2017.8.28           影响因子:18

    该研究以模式植物拟南芥为材料,在传统R-loop全基因组检测技术基础上开发出一种全新的检测方法:基于单链DNA建库的DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术(简称ssDRIP-seq, single-strand DNA ligation-based library construction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)。与已报道的全基因组R-loop检测方法相比,ssDRIP-seq表现出易操作、精准、高效、高度灵敏、可重复性好等优点,并且可获得DNA链特异性信息。基于ssDRIP-seq,该研究获得了拟南芥全基因组水平R-loop的精准分布特征,如R-loop在拟南芥基因组中分布广泛且相对稳定,与基因表达、DNA甲基化、染色质修饰、GC/AT skew等存在着紧密关系。不同于哺乳动物基因组,拟南芥中广泛存在一类反义长非编码RNA在正义链转录起始位点形成的R-loop,推测这类特别的R-loop在调节基因转录起始或控制基因转录过程中发挥重要作用。

     

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