DRIPc-seq

技术简介

细胞中存在一类被称作R-loop的特殊三链核酸结构，由DNA-RNA杂交体和相关的非模板单链DNA组成。哺乳动物细胞中约有5%的区域会形成R-loop，多数集中在转录起始区和转录终止区，由RNA Pol I，II与III转录的RNA均可与DNA形成R-loop，表明其可来源于几乎所有类型的RNA。R-loop可以在细菌到人类等生物体细胞内频繁的形成，进而影响转录并导致基因组的不稳定性，异常R-loop的形成和积累与许多疾病的发生发展具有密切关系，解析R-loop的分布和调控基因表达的机制十分重要。

DRIPc-seq可以应用于任何细胞类型，只要可以收集足够的起始材料，都可以准确绘制R-loop在各种细胞系和不同条件下的分布。在全基因组范围内提供可重复的、高分辨率的、链特异性的R-loop图谱。

实验原理

DRIPc-seq是一种高分辨率和链特异性的方法，可以精确地绘制全基因组的R环。简单地说，经过温和的DNA提取和限制性内切酶酶切片段化后，用S9.6抗体对R环结构进行免疫沉淀实验（该抗体对RNA-DNA杂交物显示出亚纳摩尔亲和力，对双链DNA几乎没有亲和力）。杂交体的RNA链通过DNase I处理释放，并用dUTP进行逆转录合成第二条链。随后用尿嘧啶- N -糖基酶（UNG）处理，确保了文库仅由一条链构建。然后在满足质量控制后对cDNA进行扩增和测序。

DRIPc-seq流程图

产品优势

灵敏度高：能够得到全基因组范围内的R-loop图谱

特异性好：背景噪音低，所需测序深度少

链特异性：采用链特异性建库，保留链的信息

实验重复性好：实验重复结果一致性好

 

样品要求

样品类型

组织、细胞、总DNA或IP后DNA。其它类型样品请详询。

样品量

a) 细胞：2×10⁷

b) 组织：100 mg

c) 总DNA：> 30 μg

样品运输及保存

样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品-80℃保存，避免反复冻融。

 

案例分析

原文：High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA–RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing

期刊：NATURE PROTOCOLS        发表时间：2019.5.3      影响因子：14.8

通过DRIP-seq和DRIPc-seq进行R环定位，能够测量任何感兴趣的基因组中r环结构的稳态分布。更重要的是，这些方法可用于由遗传扰动（基因敲除或敲低）或化学处理（药物，激素）引起的R环分布或动力学的全局变化。已发表的例子包括人乳腺癌细胞对雌激素转录诱导的反应或沉默人HEK293细胞中DNA拓扑异构酶1的后果。利用DRIPc-seq在小鼠细胞和酵母中成功地检测到了R-loop谱。