GLORI-seq

GLORI（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技术是针对m6A修饰开发的单碱基检测技术。实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测，并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量。

GLORI技术原理：

乙二醛和亚硝酸盐介导的非甲基化腺苷（A）脱氨基测序（GLORI-seq），它能够对单碱基m6A位点进行有效和无偏倚的检测，并对m6A修饰水平进行绝对定量。在亚硫酸盐的作用下鸟苷(G)和胞苷(C)也容易发生脱氨基反应，分别导致G转化为黄嘌呤(X)和C转化为尿苷(U)，并且亚硝酸引起G脱氨基的速度远快于A脱氨基，而乙二醛能够实现对可逆的对G结构的保护，使其耐受亚硝酸反应。

首先提取总RNA，进行片段化，片段化的产物经过乙二醛和亚硝酸盐处理，RNA在乙二醛和亚硝酸盐的催化体系来有效地将未甲基化的腺苷（Adenosine)脱氨基转换成形成肌苷（Inosine），肌苷在逆转录过程中与胞苷(Cytidine）配对，在测序过程中被读作鸟苷（Guanosine），但m6A保持不变，测序后仍读为A。因此，GLORI通过检测测序序列中A的比例实现了单碱基分辨。此外，我们在文库准备过程中引入了唯一分子识别符(UMI)序列，消除逆转录过程中由扩增效率引起的偏差，实现m6A的绝对定量。

mA proportion = A/(A+G)

GLORI-seq技术原理图

云序技术优势：

GLORI的技术核心是不依赖于抗体，通过化学反应组合筛选发现乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A测序后仍被读成A，从而实现对m6A的单碱基识别。GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的检测。

在文库准备过程中引入了唯一分子识别符(UMI)序列，消除逆转录过程中由扩增效率引起的偏差，实现m6A的绝对定量。

尽管当下已经开发了多种m6A检测和测序方法，但是GLORI的技术相较于基于m6A抗体的检测方法，能够得到单碱基检测。相较于基于限制性内切酶的检测技术（只能检测含有ACA 基序的m6A）实现对m6A修饰位点的99.9%的检测，范围更广。

样本要求：

样品类型：

组织、细胞、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量：

细胞：2×10⁷

组织：50mg

体液：全血、血清、血浆2-3ml脑脊液：5ml尿液：50ml

总RNA：50μg(OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5;无明显降解，电泳检测样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾)

样品运输及保存

样品置于1.5mL管中，封口膜封好，干冰运输。

细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；血液样品应使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。