羊驼纳米文库构建|文库筛选

       卡梅德生物致力于羊驼VHH抗体的产生已有9年多的时间，并拥有一支经验丰富的技术团队。据我们的实验项目数据统计，每年都有数百个羊驼VHH抗体构建服务成功交付。卡梅德生物建立了一个完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台，卡梅德生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节，并为全球的科学家提供高特异性和高亲和力的羊驼VHH抗体。
 
羊驼VHH抗体库构建背景：
 
      羊驼是骆驼科的成员，包括美洲驼（Llama）以及我们熟悉的羊驼（Alpaca）。除常规IgG外，驼科动物还产生一种功能性单链抗体，该抗体能够与抗原结合，有时称为VHH抗体。这些抗体仅由重链组成，缺乏轻链和功能性CH1和CH4结构域。这些所谓的重链抗体正被用于开发单域抗体。这些抗体的单结构域性质提供了独特的优势，使其在生物技术应用中脱颖而出。
 


图1羊驼抗体肽结构域示意图

         VHH抗体的优点：
     （1）在高温和pH下的稳定性；
     （2） VHH可以识别通常不被常规抗体识别的抗原位点；
     （3）它们的小分子片段有助于快速组织渗透和标记应用，包括跨越血脑屏障；
     （4）用于大规模生产节约成本的替代品。
         卡梅德生物使用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体（纳米抗体）表面展示。我们的科学家构建了带有Flag和6×His标签双标签的噬菌体载体，并制备了具有10⁸转染效率的TG1和XL1 Blue宿主细胞，经过2-3次转染和扩增，可以为客户提供高质量的VHH抗体展示文库，其足够的库容量为10⁸-10⁹，包装容量为10¹³-10¹⁶/ml。通过抗原限制压力筛选多轮纳米抗体文库，可获得多达20-30株高亲和力噬菌体菌株。最后通过简单的IPTG诱导，可以在1-2周内获得大量抗体表达产物，以满足客户的研究需求，例如FACS和细胞活性测试。
 
制备流程：
 

 
服务内容：
 

步骤	服务内容	周期
羊驼免疫	* 一只健康的成年羊驼（28-36月大）免疫5-7次 * ELISA效价测定 * 抗血清采集	8-10周
cDNA制备（客户可以提供细胞）	* 总RNA提取 * 高保真RT-PCR制备cDNA	1个工作日
VHH抗体库构建	* 引物设计与合成 * 以cDNA为模板，PCR扩增重链抗体基因可变区 * 噬粒构建与转化：酶切、连接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库 * 鉴定：随机挑选20-50个克隆，PCR鉴定、测序、分析抗体序列	3-4周
VHH抗体库筛选（3轮）	* 抗原极限施压法进行3轮筛选 * 鉴定：随机挑选96个克隆，ELISA效价测定 * 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清	4-5周

 
交付：
 
--VHH抗体库2ml，>1⨯10¹³/ml噬菌体颗粒，有效库容量>10⁸
--表达10-15个阳性克隆以制备VHH抗体上清液
--实验报告：实验步骤和序列测定信息和比对结果
--原始数据：可根据客户要求提供我完整实验记录原始数据
 
服务优势：
 
--提供免疫库构建服务和天然羊驼抗体库筛选服务
--约16-19周可获得周期短、质量高的文库和单克隆抗体细胞系
--高库容量：足够的库容量10⁸-10⁹/免疫库
--高亲和力抗体构建
--个性化方案分析和定制
--完整的文件追溯提和QC质量控制文件

公司介绍：
卡梅德生物科技（天津）有限公司作为国家高新技术企业，专注于为全球科学家和研究机构提供天然蛋白提取与发酵、重组蛋白定制表达服务，单、多克隆抗体开发，噬菌体文库构建与筛选服务；同时，基于我公司成熟的五大核心技术服务平台，成功研发了众多用于科学研究的重组蛋白、抗体、抗体药物靶点蛋白、工业酶、诊断原料等相关试剂。

核心平台：

---噬菌体抗体展示技术平台

卡梅德生物科技有限公司利用自有的噬菌体（M13，T7噬菌体）展示技术平台，能够为客户提供高性价比的重组VHH抗体（纳米抗体/驼类纳米抗体）制备方案，包括动物免疫，文库建立，文库筛选以及重组抗体的体外表达等。
 

---抗体工程技术平台

卡梅德生物科技的抗体工程平台包含单克隆抗体制备服务平台，多克隆抗体制备服务平台，抗体测序与改造平台。 单克隆抗体制备平台：基于杂交瘤技术的小鼠单抗技术平台，能够在2-3个月获得高亲和力与高特异性的单克隆抗体，同时基于噬菌体展示技术，我司能够制备多物种的重组单克隆抗体，包括小鼠，兔子，骆驼，羊驼以及人单抗。

多克隆抗体制备服务平台：能够为客户提供兔多抗，羊多抗，骆驼类多抗，牛多抗等多物种的抗体制备服务，根据不同的抗原类型，来自卡梅德生物的抗体专家会为您量身定做适合您需求的方案，以满足您的项目要求并节省您的宝贵时间。

抗体一级序列测序平台：为满足大量客户对抗体基因序列与氨基酸序列信息的需求，我们为客户提供De Novo抗体全长氨基酸序列解析和N端测序服务；同时我们设计积累多达80种杂交瘤抗体基因测序引物。

抗体改造技术平台：卡梅德生物技术的抗体改造平台包括嵌合抗体制备，抗体亲和力成熟以及抗体人源化服务。目前我们已经成功制备十几例嵌合抗体与人源化抗体，均成功交付。

 

---蛋白表达与纯化服务技术平台

卡梅德生物科技目前拥有四大蛋白表达平台，能为客户提供优质的蛋白表达技术服务。

哺乳动物表达平台： 目前公司拥有Freestyle CHO，Expi CHO，CHO-DG44，HEK293F，Vero等细胞系用于蛋白表达制备。公司秉承质量优先原则，全部统一采用Gibco细胞培养基和相关转染配套试剂，以保证每个批次的哺乳动物细胞蛋白表达产品高质量、高表达水平的交付。同时公司拥有的表达载体体系，相比市面常用蛋白表达载体，能够为客户提供更高纯度的蛋白。

昆虫细胞表达平台：目前公司常采用的昆虫表达细胞为SF9，配套使用的是来自Gibco的培养基，只为更快、更好地为客户提供高质量的产品。利用该蛋白表达平台，我们已经成功制备了多种人源跨膜蛋白，包括多种GPCR家族成员蛋白。

原核蛋白表达平台：大肠杆菌（E.coli）重组蛋白表达技术经过多年的发展，已经积累了很多的经验。但如果要在大肠杆菌表达体系获得不错的可溶以及高产量的蛋白表达，一个全方位设计的表达策略必不可少。卡梅德生物科技的专家团队在蛋白表达和抗体制备方面具有丰富的经验和知识储备，针对每位客户的需求，我们的都会提供具体的方案设计。

酵母蛋白表达平台：毕赤酵母，酿酒酵母等蛋白表达体系，适用于需要真核表达蛋白，同时兼具产量与性价比的项目需求特点。

植物表达平台：为了提供更好的服务，卡梅德生物携手国内重点科研单位共同为客户提供基因烟草瞬时转染技术的植物蛋白表达服务，项目从设计构建到蛋白表达只需要4-6周。该技术平台能够为客户在较短的时间内获得高纯度，高质量的植物来源的蛋白，已解决大部分植物蛋白在上述几大蛋白表达系统中不溶或不表达的难题。

---蛋白批量发酵平台

超高密度发酵技术：卡梅德生物科技能够为客户提供5L，10L,30L，80L体积的贴壁细胞高密度发酵技术服务（微载体贴壁培养技术），人源细胞贴壁细胞培养密度高达4x106个/ml，适用于病毒转染类型的蛋白高产量表达发酵，能够做到1g/L发酵水平。利用该技术平台，我们目前完成的重组抗体发酵表达记录高达4.7g/L发酵水平。

同时，借助有氧发酵技术，我们能够为客户提供原核和酵母的超高密度发酵服务，采用有氧发酵类型的原核发酵技术，蛋白产量比传统的原核发酵要高（相差接近100倍蛋白产量和得率）。

---蛋白纯化技术平台：

我司分别配制了Akta和BioRad Biological的蛋白纯化仪，同时拥有GE全套填料，包括Sphedax 75/200,500, G25,G100，CMFF,Q-FF，DEAE以及不同规格的预装柱等，能够在1-2周内为客户完成一套蛋白纯化的工艺开发小试方案。我司的科研团队成员均来自国内生物制药企业，硕士博士学历占比98%，因此有能力为客户提供快速，高质量天然蛋白和跨膜蛋白的纯化等优质服务。

 

---稳定细胞系筛选平台与基础分子生物平台

稳定细胞系构建平台：卡梅德生物可为客户定制不同类型的稳定细胞系构建与筛选服务，如利用Crisper/Cas9的多物种、多细胞系来源的细胞沉默，敲除，过表达等稳定细胞系；同时我们也为客户提供基于电转或脂质体转染（Lipofectin2000/3000）的稳定转染细胞系构建服务，如CHO细胞蛋白高表达细胞株等。

卡梅德生物的基础分子生物学平台承担了包括基因克隆，蛋白定量，免疫印迹检测（SDS-PAGE、WB），宿主核酸检测，蛋白抗体亲和纯化，ELISA操作，内毒素检测，HPLC分析，免疫组化，IP，免疫浊度，流式细胞术等服务。