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- 核转录因子NF-kappaB（NF-kB）是一种重要的转录因子，参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。
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- 2025年07月11日
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NF-KB p65活性检测实验
核转录因子NF-kappaB（NF-kB）是一种重要的转录因子，参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。
NF-kappaB（NF-kB）最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和 p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65， p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和 p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。
IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和 DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应（14）。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓 度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的 0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙.烯.酰胺凝胶电泳中分离 凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加 剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复 合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列 特异的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。
下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng的Co+3(NH3)6 （12）。
提取组织或细胞核蛋白，利用不同形式的NF-Κb p65抗体捕获细胞核蛋白并加以区分，通过酶标仪450nm 处测定核蛋白标准品与NF-Κb p65吸光度值，进行定量比较，从而明确目的蛋白的活化度。
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文献和实验定量检测可以么？ 细胞因子 wrote: 可以，做完WB后用Image软件经行成像分析，可以半定量检测。园子里有很多这方面的帖子，你可以看看。 楼主的这种情况，只用western 做Ikba和p-Ikba的半定量检测是不可以的，或者说是不严谨的。 首先，你要知道Nf-kb的激活通常与IkBs（IkBa、IkBβ、IkBε）的降解降解有关，但这并不绝对，也不是其唯一的途径，比如P50、p65的表达调节也可影响Nf-kb，况且IkBs还可细分为三种
【求助】用免疫组化的方法检测出来的NF-kB是指活化了的NF-kB吗？
songyong 各位亲们：请问用免疫组化的方法检测出来的NF-kB 是已经活化了的NF-kB呢？还是无活性的也包括进去啦？谢谢 ronaldo_zj 体内的细胞信号通路研究确实不好评价，不过就NF-kappaB这个通路来说，我个人觉得可以通过一下几个方法来衡量： 1. 经典的NF-kappa B的活化往往都是NF-kappaB（包括p50、p65、p52等）作为转录因子活化而转位至细胞核内发挥转录调节功能
ws88523758 小弟对于实验处于纯菜鸟，糊里糊涂的做了半年多了，结果数据参差不齐，临近毕业，焦虑万分，特停高手们指导求救！ 我做的是大鼠的系膜细胞，用TNF-α刺激后，再用中药干预24h，测细胞上清中的ikb和NF-KB,用的都是ELISA法。 ikb测值很低，据查当IKBα被磷酸化后分解后，P65和P50才能解离激活。所以，当刺激开始的时候，磷酸化的IKBα上调，IKBα下调。由于P65活化后又可以上调IKBα表达，所以，经过一定时间之后
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