DAP-seq（DNA亲和纯化测序）

 转录因子（transcription factor, TF）是序列特异性DNA结合蛋白，可调节所有生物体中的基因表达，它们占全部物种所有蛋白编码基因的4~10%。例如，模式植物拟南芥中有2492个基因编码TF，占其总蛋白质编码基因的9%以上。

DAP-seq（DNA affinity purification sequencing，DNA亲和纯化测序）属于类ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序，Chromatin immunoprecipitation sequencing）的体外实验。它通过体外蛋白表达技术，表达出带有标签的TF，和基因组DNA文库在体外进行结合，然后分离出与TF结合的DNA，再使用高通量测序，找到TF的结合位点。 DAP-seq的基本步骤包括：a）获得基因组DNA，打断后连接测序接头；b）表达连接标签的融合蛋白（目标TF）；c）融合蛋白连接抗体直标磁珠；d）基因组DNA与目标TF融合蛋白一起孵育，利用磁铁富集与目标TF结合的DNA片段，并进行测序。如下图所示：

服务流程

您只需要提供目标TF的cDNA、TF-标签融合基因的质粒或者表达好的目标TF及其抗体（三选一），和用于基因组DNA提取的样品，剩下的工作我们来完成！

 

全面鉴定基因组上转录因子结合位点（transcription factor binding sites, TFBS）对于表征调控元件和TF功能至关重要。ChIP-seq一直是检测体内TFBS的金标准。然而，ChIP-seq并非所有情况都适用，因为：

• ChIP-seq依赖于抗体质量，人、小鼠等这些常见模式物种的热门TF，通常有商业化的ChIP级抗体可用，但对于非热门TF或非模式物种，往往没有可用的商业化抗体；而制备ChIP级抗体难度大，周期长，很不可控。
• 对于没有抗体的TF，替代方案之一是通过转基因的手段，将重组TF序列导入到细胞或实验动/植物体内，表达TF-标签（如FLAG肽段或绿色荧光蛋白GFP）融合蛋白，再利用标签抗体，实现目标TF的ChIP-seq；然而，对于某些物种，转基因实验难度很大或周期很长，实验门槛极高。
• TF在植物的体内表达量低，还存在时空特异性，取得足量特定生长时期的特定部位组织，往往并不容易。

DAP-seq成功将体内结合实验转移到体外，解决了ChIP抗体制备的困扰，极大的提高发现TFBS的效率;不仅能够超高通量查找TFBS，还能深入了解众多TF的生物学特性和TFBS结构，在有机体的表观研究中表现出巨大的价值。
 

但是，DAP-seq作为一种体外实验，某些缺点是不可避免的：

• 很多TF在体内起作用必须要有其他配体蛋白的协助，但在体外环境下，缺乏这些条件；体外环境下，蛋白翻译后无法正常折叠或形成多聚物，从而无法行使在体内环境类似的功能。这与TF的类型（即TF家族）高度相关，因此，如果想用DAP-seq研究某个目标TF，则可以先查询在之前的研究中，该TF隶属家族的成功率如何，从而预估目标TF的实验成功率。
• DAP-seq无法检测组蛋白修饰、染色体开放程度等因素对TF作用的影响，因此，DAP-seq不适用于研究TF与DNA作用的动态变化，研究静态TFBS时，一个物种只需做一次。

 

案例分析

Cell:  Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape¹

本研究对比了ChIP-seq和DAP-seq两种方法检测给定TF结合位点的效果，通过DAP-seq，解析了拟南芥中529个TFs的peaks和motifs。

1）TF ABI5的ChIP-seq和DAP-seq peak区域高度一致，解析到的motif序列也高度一致。

2)  DAP-seq能够大规模、高通量的转录因子的TFBS和motifs，在鉴定的529个TFs中，有57个代表性的motifs。

参考文献：

O'Malley RC, Huang SC, Song L, Lewsey MG, et al. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape. Cell. 2016;165(5):1280-92.

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