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- CRISPR-Cas9基因敲除
- 武汉
- 2026年04月19日
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BrainVTA
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CRISPR-Cas9基因敲除服务
一、原理介绍
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break，DSB），机体自身通过非同源末端重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。
图1.CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）
图2.非同源重组修复DSB（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）
二、应用实例
1.利用CRISPR/Cas9去除HBV感染（Zhen S, et al.Gene Ther.2015）
图3.靶向HBV基因组不同位置的gRNA
图4.靶向S基因的gRNA-S1和靶向X基因的gRNA-X3介导Cas9对HBV基因组的编辑产生突变，被T7E1错配酶识别
图5.Cas9和gRNA-(S1+X)共转至HBV转基因小鼠模型，能持续抑制血清中乙肝标志性抗原（HBsAg）的含量
2.利用CRISPR/Cas9进行基因治疗（Maeder ML, et al.Nat Med.2019）
莱伯氏先天性黑曚10型是一种单基因遗传病，是由于CEP290基因第26号和第27号外显子之间的突变造成mRNA错误剪接从而导致蛋白质缺失引起的，基因治疗公司Editas利用AAV载体表达SaCas9和靶向突变位点两端的gRNA，在体对CEP290基因进行编辑，删除突变的内含子序列或造成该区域翻转从而破坏错误的剪接位点，帮助形成正确的mRNA。
3.利用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤模型（Maresch R, et al.Nat Commun.2016）
超过90%的人胰腺癌有KRAS突变，利用Ptf1a-Cre在胰腺特异诱导KRAS G12D突变基因表达,能诱导小鼠产生胰腺癌，但所需时间长达数月甚至一年以上。利用CRISPR-Cas9基因编辑在上述小鼠模型体内同时突变15个与胰腺导管腺癌（PDAC)相关的基因，可快速诱导PDAC产生，诱导成瘤中位时间为10周左右，到第24周，约54%的基因编辑小鼠能产生肿瘤。
三、我司提供病毒载体及细胞系构建服务
服务内容
1、sgRNA的设计；
2、细胞内sgRNA剪切活性筛选；
3、敲除载体的构建；
4、依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式：
a、脂质体易转染细胞：使用质粒系统（Cas9和sgRNA）；
b、脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染（Cas9和sgRNA）；
5、筛选基因敲除单克隆细胞系。
服务流程
需客户提供：
1、目的基因序列（ID）以及物种来源；
2、需介导基因敲除的细胞（可选）；
3、病毒类型选择以及要求；
4、血清型选择。
表1.服务信息及最终交付内容、产品
| 流程分布 |
周期 | 交付内容 | 交付产品 |
| sgRNA序列的设计 | 2-4周 | sgRNA设计分析报告 | - |
| sgRNA的活性筛选 | 获得有活性的sgRNA及筛选报告 | ||
| 基因敲除质粒的构建 | 1周 | 基因敲除质粒报告 | 基因敲除质粒 |
| 病毒包装 | 3周 | 病毒包装报告 | 高纯度病毒 |
| 单克隆细胞分选 | 8周 | 单克隆细胞分选及检测结果报告 | 基因敲除单克隆细胞系 |
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文献和实验以最火热的 p53 为例Step1 先找 p53 基因序列1. NCBI--输入 p53 并选择物种 human：tumor protein p53 [Homo sapiens (human)]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene2. Ctrl+F，输入 sequence，快速定位（当然其实拉下去就是了），点击 Genebank3. 下载 p53 基因序列4. 用 SnapGene 软件打开序列，并简单了解每个元件最好是可以学一下 SnapGene 这个软件的使用
设计了 sgRNA 之后怎么办呢？还是这篇文章先讲一下这里的框架首先是实验设计Experimental design1. Target selection for sgRNA--选择靶点详情见：CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计 https://www.jianshu.com/p/ 8222f449cb442. Approaches for sgRNA construction and delivery.sgRNA 的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的 sgRNA
CRISPR/Cas9 基因敲除实验-- sgRNA 及引物设计
前期记录先确定目标基因CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 确定目标基因然后对目的基因进行背景调查CRISPR/Cas9 基因敲除实验-- 目标基因背景调查设计 sgRNA 及引物CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计好之后对前期文章的补充：设计 sgRNA 之后，需要对结果进行判断：但为什么 0.7044 分数的哪一个没有选，我也不知道为什么，总感觉他们的顺序不是随意的排的。或许有人能解答一下为什么。顺手把设计工具的解说放上
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