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北京永欣康泰科技发展有限公司
Realtime PCR 检测实验
Realtime PCR 检测实验
1.组织取样要求:最好取材100mg,最少不低于50mg,脂肪组织,结缔组织适当增加取材量
2.新鲜组织立即放入液氮中,速冻后,放入-80摄氏度冰箱储存,干冰运输
Realtime PCR 检测实验流程
1.主要试剂
Trizol试剂盒:购自Invitrogen公司
PCR引物:生工生物工程(上海)有限公司
M-MLV反转录试剂盒:购自Promega公司
SYBR mix:瑞士Roche
2.主要仪器
Real-TimePCR仪:美国 ABI 7500
4℃低温高速离心机 Thermo 美国
3. 实验流程
(一) 组织样本总RNA的提取
样品放入1.5mL离心管,加入1mL TRIzol,静置5min,4℃12000xg离心5min。
a.以0.2mL/mLTrizol的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,待充分乳化溶液呈乳白状,室温放置10min
b.4℃12000xg离心15min。离心后溶液分为三层,由下至上为:淡粉的酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水相,RNA在水相中,约500µL
c.取上层水相400µL于一新的离心管,按0.5mL /mL Trizol的比例加入异丙醇,室温放置20min
d.4℃ 12000g离心15 min。RNA沉淀后呈胶状片层
e.弃上清,按1mL/mL Trizol液加入75%乙醇
f.轻轻上下翻转,静置5min,4℃ 12000xg离心10min
g.小心弃上清,用超净工作台上的无菌风吹干,时间3-5min
h.将RNA溶于30-50µL DEPC水中。静置5min用枪吹打使其溶匀
i.核酸紫外分光光度计测定经稀释的RNA提取物的OD值和浓度,判断RNA纯度,计算RNA浓度。
j.RNA样品长期保存于-80℃冰箱
(二) RNA的体外反转录及PCR
1.将下列试剂加入0.2mL的离心管中。
RNA | 1µg |
10XDNaseI Buffer | 1µL |
DNaseI | 1µL |
ddH2O.DEPC | 补至 8µL |
37℃作用30min
EDTA | 1µL |
Random primer | 2µL |
以上首先70℃孵育10min,然后迅速放在冰上骤冷1min。
5XBuffer | 5µL |
dNTP(10mM) | 1µL |
M-MLV RT | 0.5µL |
ddH2O | 5.5µL |
总共25µL体系 |
2.以上42℃孵育60min,然后70℃ 10min
3.Real-Time PCR
将所得的cDNA加入75µL ddH2O稀释用作Real-TimePCR模板
与下列物质加入0.2mL的离心管中混匀
Real-TimePCR体系:
cDNA | 2µL |
引物1(10pmol/µL) | 0.5µL |
引物2(10pmol/µL) | 0.5µL |
SYBR mix | 10µL |
dd H2O | 7µL |
20µL |
Real-Time PCR程序设置:
94℃预变性2min
94℃ 15s 45循环
60℃ 1min
72℃ 10min
(三)计算方法
用相对定量2-ΔΔCT法分析结果,用各个样本的目的基因的Ct值﹣各个样本的看家基因(GAPDH)的Ct值,得到deltaCt;用delta Ct﹣对照组的均值,得到deltadelta Ct
(-ΔΔCT)。用2-ΔΔCT计算各个样本目的基因的相对表达变化。
构建动物模型名称 | 适用范围 |
1、裸鼠肿瘤(皮下、原位)动物实验 | 胰腺、肝、胃原位接种、皮下接种 |
2、兔 腹主动脉、颈动脉硬化(球囊法)模型 | 稳定制备 颈动脉、腹主动脉硬化模型 |
3、心肌缺血、大、小鼠、兔、小型猪心电图、心脏超声、病理评价 | 心肌缺血及再灌注、心梗、血压测定(麻醉及清醒状态下)等 |
4、Ⅰ、Ⅱ型糖尿病大小鼠、兔动物模型 | 高脂诱导+STZ制备糖尿病模型及糖尿病并发症研究,药效评价 |
5、骨质疏松大鼠、小鼠实验(去势) | 老年性骨质疏松相关疾病临床前药效评价 |
6、股骨头坏死、骨缺损、鼠、兔模型 | 镇静、镇痛动物模型,行为学模型制作及药物筛选 |
7、Apoe小鼠动脉粥样硬化整体实验 | 高脂饲养、取材、病理实验、大体染色等 |
8、急性粒细胞白血病动物实验 | |
9、肾结石快速成模大鼠模型 | 乙二醇致大鼠肾脏草酸钙结石模型 |
10、眼科大小鼠模型、视网膜铺片、 玻璃体腔内注射 |
眼科疾病模型及相关检测方法 |
11、脑缺血、帕金森、脑出血动物模型 | 脑病实验、颅内注射、技术成熟稳定 |
12、肾脏缺血、肾移植、肾衰动物模型 | 肾脏缺血、肾移植、肾衰竭实验及检测平台 |
服务项目 | 服务承诺 | 服务周期 | 样本种类 |
病理切片、免疫组化 | 染色结果照片 | 2-3周 | 组织 |
Western blotting | 胶片 | 1-2周 | 蛋白样本或组织 |
流式细胞服务 | 散点图、分析数据、设备信息等 | 1-2周 | 血样、骨髓等 |
细胞凋亡检测 | 凋亡图、数据分析 | 细胞 | |
RT-PCR | 扩增图 | 1-2周 | RNA或组织 |
血压监测(无创式) | 实时血压数据 | 大、小鼠 |
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