验证乳酸产生对EIMP的必要性
确定胞葬作用诱导的乳酸产生是否对EIMP至关重要。
使用LDHA抑制剂FX11或Ldha基因敲除的BMDMs和HMDMs，检测AC诱导的细胞增殖和Myc蛋白表达，并添加外源性乳酸进行恢复实验。
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胞葬作用诱导的乳酸通过促进促消退巨噬细胞的增殖介导组织修复
Efferocytosis-induced lactate enables the proliferation of pro-resolving macrophages to mediate tissue repair
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDMs、HMDMs）、体内小鼠模型（地塞米松胸腺凋亡模型）、多种功能验证（LDHA敲除/抑制、SIRT1抑制、GPR132敲低等）和机制验证（Myc乙酰化、NAD+/NADH比例、SIRT1活性）。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 人单核细胞来源巨噬细胞（HMDMs） 地塞米松诱导胸腺细胞凋亡小鼠模型
重点核对
LDHA活性抑制（FX11）或基因敲除（Ldhafl/fl;LysMCre+/−）对Myc蛋白和EIMP的影响 乳酸补充（10 mM）对Myc蛋白和EIMP的恢复作用 SIRT1活性（EX527抑制）对Myc蛋白和EIMP的影响 AMPK活性（Compound C抑制）对Myc蛋白和EIMP的影响 GPR132信号（telmisartan抑制、ONC212激活）对Myc蛋白和EIMP的影响
摘要
巨噬细胞对凋亡细胞的清除（胞葬作用）可防止坏死和炎症，并激活促消退通路，包括持续的胞葬作用。体内一个关键的消退过程是胞葬作用诱导的巨噬细胞增殖（EIMP），其中凋亡细胞来源的核苷酸触发Myc介导的促消退巨噬细胞增殖。在这里，我们显示EIMP需要与细胞代谢整合的第二个输入，特别是胞葬作用诱导的乳酸产生。乳酸通过GPR132信号传导促进Myc蛋白稳定化和随后的巨噬细胞增殖。该机制在小鼠地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡模型中得到了体内验证，该模型升高了凋亡细胞负荷并需要胞葬作用来防止炎症和坏死。因此，EIMP是组织消退中的一个关键过程，需要来自两个独立过程的输入：由凋亡细胞来源的核苷酸诱导的信号通路和涉及乳酸产生的细胞代谢通路。这些发现说明了胞葬巨噬细胞中看似不同的通路如何被整合以执行组织消退中的关键过程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胞葬作用诱导的巨噬细胞增殖（EIMP）是否需要与代谢相关的第二个输入，以及乳酸是否通过稳定Myc蛋白来促进EIMP。
- 核心机制
- 胞葬作用诱导的乳酸通过GPR132-PKA-AMPK-NAD+-SIRT1通路促进Myc蛋白去乙酰化和稳定化，从而驱动EIMP。
- 主要证据
- 体外实验显示LDHA抑制或敲除降低Myc蛋白和EIMP，乳酸补充恢复；SIRT1、AMPK、GPR132的药理或遗传操作影响Myc蛋白和EIMP；体内实验显示LDHA敲低减少胸腺巨噬细胞Myc和Ki67表达，损害胞葬作用和组织修复。
- 研究意义
- 该研究阐明了EIMP的代谢调节机制，为理解组织消退和慢性炎症疾病提供了新的视角，并提示GPR132激动剂可能作为治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证乳酸稳定Myc蛋白的机制
确定乳酸是否通过抑制蛋白酶体降解来稳定Myc蛋白。
用蛋白酶体抑制剂MG132处理LDHA敲除或FX11处理的巨噬细胞，检测Myc蛋白水平；另外检测Myc乙酰化水平。
验证SIRT1在乳酸稳定Myc中的作用
确定SIRT1是否作为乳酸下游效应器介导Myc去乙酰化和稳定。
检测SIRT1活性、表达，使用SIRT1抑制剂EX527或siRNA沉默SIRT1，评估对Myc蛋白和EIMP的影响。
验证AMPK-NAD+通路在乳酸下游的作用
确定乳酸是否通过激活AMPK升高NAD+/NADH比例，进而激活SIRT1。
检测AMPK磷酸化、NAD+/NADH比例，使用AMPK抑制剂Compound C或NMN补充，评估对Myc蛋白和EIMP的影响。
验证GPR132-PKA信号介导乳酸作用
确定乳酸是否通过GPR132受体和PKA信号激活AMPK。
使用GPR132抑制剂telmisartan或siRNA沉默GPR132，以及PKA抑制剂H89，检测Myc蛋白和EIMP。
体内验证LDHA依赖的乳酸在EIMP和组织修复中的作用
确定在生理情况下，LDHA依赖性乳酸产生是否对EIMP和凋亡细胞清除至关重要。
利用地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡模型，对LDHA敲低小鼠的胸腺巨噬细胞进行免疫染色分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| L-929细胞条件培养基 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | -- |
| β-巯基乙醇 | Sigma | -- | |
| SDS-PAGE梯度凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 抗SIRT1抗体 | CST | 9475 | |
| 抗LDHA抗体 | ProteinTech | 19987-1-AP | |
| 抗pAMPK抗体 | CST | 2535 | |
| 抗AMPK抗体 | CST | 5831 | |
| 抗pCREB抗体 | CST | 9198 | |
| 抗CREB抗体 | CST | 4820 | |
| 抗乙酰化cMyc抗体 | Sigma | ABE26 | |
| 抗cMyc抗体 | CST | 18583 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | CST | 9681 | |
| 抗β-肌动蛋白HRP偶联物 | CST | 5125 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | CST | 7076 | |
| HRP标记的抗兔IgG | CST | 7074 | |
| 免疫沉淀 | Pierce IP裂解液 | ThermoFisher | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | -- | |
| Pierce蛋白A/G磁珠 | ThermoFisher | -- | |
| 对照兔IgG | CST | 3900 | |
| RapiGest SF表面活性剂 | Waters | 186001861 | |
| 免疫荧光 | Hoechst-33342 | CST | 4082 |
| 鸡抗兔AF647二抗 | Invitrogen | A-21443 | |
| 抗Ki67抗体 | abcam | ab16667 | |
| 抗Mac2抗体 | Cedarlane | CL8942LE | |
| 山羊抗兔AF488 | Invitrogen | A11034 | |
| 山羊抗大鼠AF647 | Invitrogen | A21247 | |
| 细胞处理 | FX11 | Sigma | -- |
| EX527 | Sigma | -- | |
| Compound C | Sigma | -- | |
| H89 | Sigma | -- | |
| MG132 | Sigma | -- | |
| 乳酸 | Sigma | -- | |
| 烟酰胺单核苷酸 | Sigma | -- | |
| 替米沙坦 | MedChemExpress | -- | |
| ONC212 | MedChemExpress | -- | |
| TAT-Cre重组酶 | Millipore | -- | |
| 分子生物学 | Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| PureLink RNA小提试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| NanoDrop分光光度计 | ThermoFisher | -- | |
| Superscript II反转录酶 | Applied Biosystems | -- | |
| 7500实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 代谢检测 | 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK064 |
| NAD/NADH比色检测试剂盒 | Abcam | -- | |
| SIRT1活性检测试剂盒 | Abcam | -- | |
| 细胞计数 | Countess II自动细胞计数仪 | Invitrogen | -- |
| 组织学 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Sigma | -- |
| 柠檬酸盐抗原修复液 | Vector | -- | |
| Leica荧光显微镜 | Leica | DM16000B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞凋亡诱导 | Jurkat细胞凋亡诱导方法：紫外线照射15分钟；AC与巨噬细胞比例5:1；孵育时间45分钟 阅读提示：Methods: Generation of ACs and incubation with macrophages |
| 药物处理 | FX11浓度50 μM；EX527浓度10 μM；Compound C浓度10 μM；H89浓度10 μM；MG132浓度10 μM；乳酸浓度10 mM；NMN浓度500 μM；telmisartan浓度10 μM；ONC212浓度20 μM 阅读提示：Methods: Generation of ACs and incubation with macrophages |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度：BMDMs 100,000/孔（12孔板）；AC处理后追踪24小时；HMDMs用0.25%胰蛋白酶消化 阅读提示：Methods: Cell counting |
| 蛋白表达检测 | 抗体稀释比例：anti-cMyc 1:1000；anti-SIRT1 1:1000；anti-pAMPK 1:1000等 阅读提示：Methods: Immunoblotting |
| 体内模型 | 小鼠：雄性C57BL/6J，8-10周龄；照射剂量10 Gy；骨髓移植细胞数2.5×10^6；地塞米松剂量250 μg；取材时间18小时 阅读提示：Methods: Experimental animals, BMT, Dexamethasone-thymus assay |