建立小鼠前列腺癌模型并观察转移表型
评估STAT3缺失或组成性激活对PTEN缺失背景下前列腺癌进展和转移的影响
利用PB-Cre介导的前列腺上皮特异性敲除，构建Ptenpc−/−Stat3pc−/−和Ptenpc−/−Stat3C/+小鼠，并通过生存曲线、前列腺重量、组织学和免疫组化观察肿瘤和转移情况。
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STAT3/LKB1通过调控mTORC1/CREB通路控制转移性前列腺癌
STAT3/LKB1 controls metastatic prostate cancer by regulating mTORC1/CREB pathway
实验完整度
高包含基因工程小鼠模型、细胞系敲低/回补、异种移植瘤、患者样本TMA、蛋白质组学和ChIP等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Ptenpc−/−Stat3pc−/−小鼠模型 Ptenpc−/−Stat3C/+小鼠模型 22Rv1细胞系异种移植瘤 PC3细胞系异种移植瘤
重点核对
小鼠品系：C57BL/6和129/Sv混合背景 二甲双胍剂量：50 mg/kg，每日一次，腹腔注射 22Rv1异种移植瘤连续治疗19天；PC3连续治疗12天 临床相关二甲双胍浓度：约70 µM 患者队列：80例PCa合并2型糖尿病患者（41例二甲双胍治疗，39例未治疗）
摘要
前列腺癌（PCa）是男性常见且致命的癌症类型。转移性前列腺癌（mPCa）是其致死的主要原因，但其机制仍不清楚。PTEN是mPCa中最常缺失的基因之一。在这里，我们展示了在mPCa患者的液体活检中，PTEN和STAT3频繁发生基因组共缺失。在Pten缺失的小鼠前列腺模型中，Stat3的缺失导致LKB1/pAMPK水平降低，同时激活mTOR/CREB，导致转移性疾病。然而，STAT3的组成性激活导致高水平的LKB1/pAMPK并抑制mTORC1/CREB通路，从而阻止mPCa的发展。二甲双胍是治疗2型糖尿病最广泛使用的药物之一，它抑制肝脏中的mTORC1，并且需要LKB1来介导葡萄糖稳态。我们发现，用二甲双胍处理表达STAT3/AR的PCa异种移植瘤，可显著减少肿瘤生长，同时降低mTORC1/CREB、AR和PSA水平。缺失STAT3/AR的PCa异种移植瘤几乎完全消除了二甲双胍介导的mTORC1/CREB抑制。此外，对患有高Gleason分级和2型糖尿病的PCa患者进行二甲双胍治疗，导致mTORC1水平检测不到，STAT3表达上调。此外，高表达CREB的PCa患者临床结局更差，PCa复发和转移性复发的风险显著增加。总之，我们已证明STAT3通过LKB1/pAMPK/mTORC1/CREB信号控制mPCa，我们已将其确定为治疗致死性mPCa的有前景的新型下游靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- STAT3是否通过调控LKB1/AMPK/mTORC1/CREB通路影响转移性前列腺癌的发生发展？
- 核心机制
- STAT3直接结合LKB1（STK11）启动子，转录调控LKB1表达，进而通过LKB1/AMPK抑制mTORC1/CREB信号通路；STAT3缺失导致LKB1/pAMPK水平降低，解除对mTORC1/CREB的抑制，促进转移。
- 主要证据
- Pten缺失小鼠模型中Stat3缺失或激活导致的转移表型差异，22Rv1细胞中STAT3敲低降低LKB1表达，ChIP验证STAT3结合LKB1启动子，异种移植瘤和患者样本中二甲双胍对mTORC1/CREB的抑制依赖STAT3。
- 研究意义
- STAT3/LKB1/mTORC1/CREB通路可能成为治疗致死性mPCa的新靶点，二甲双胍可能作为雄激素依赖性PCa的联合治疗药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证STAT3对LKB1的转录调控
确定STAT3是否通过直接结合LKB1（STK11）启动子调控其表达
在22Rv1细胞中敲低STAT3检测LKB1 mRNA和蛋白水平，并在STAT3缺失的MEF细胞中验证；通过ChIP实验检测STAT3与LKB1启动子的结合。
检测mTORC1和CREB信号通路活性
分析STAT3状态对mTORC1/CREB信号通路的影响
通过Western blot和IHC检测小鼠前列腺组织和细胞中p-4E-BP1、4E-BP1、p-S6、S6、p-CREB和CREB的表达。
异种移植瘤模型验证二甲双胍的STAT3依赖性抗肿瘤作用
评估二甲双胍对STAT3表达阳性和阴性的PCa异种移植瘤的生长和mTORC1/CREB信号的影响
使用22Rv1（STAT3阳性）和PC3（STAT3阴性）细胞建立皮下异种移植瘤，待肿瘤长至100-150 mm³后，每日腹腔注射二甲双胍（50 mg/kg）或对照，持续12或19天，测量肿瘤体积和重量，并通过Western blot检测相关蛋白。
患者样本分析验证临床相关性
评估STAT3、CREB与mTORC1相关蛋白在PCa患者中的表达及其与临床预后的关联
利用两个TMA队列（80例PCa合并2型糖尿病患者，83例PCa患者）进行IHC分析，检测STAT3、p-4E-BP1、4E-BP1、p-S6、CREB等表达，并分析其与生化复发和转移复发的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | STAT3抗体 | CST | 9139 |
| LKB1抗体 | Abcam | ab15095 | |
| p-AMPK抗体 | CST | 2535 | |
| p-4E-BP1抗体 | CST | 2855 | |
| 4E-BP1抗体 | CST | 9644 | |
| p-S6抗体 | CST | 2211 | |
| PTEN抗体 | CST | 9188 | |
| Ki-67抗体 | Novocastra | NCL-KI-67-P | |
| Cleaved Caspase 3抗体 | Cell Signaling | 9661 | |
| p-CREB抗体 | CST | 9198 | |
| CREB抗体 | CST | 9197 | |
| AMACR/p63双染 | Dako | M361601-2 | |
| Ventana Anti-p63 (4A4) 小鼠抗人单克隆抗体 | Ventana | 790-4509 | |
| Western blot | STAT3抗体 | CST | 9139 |
| LKB1抗体 | CST | 3047 | |
| p-4E-BP1抗体 | CST | 9451 | |
| 4E-BP1抗体 | CST | 9644 | |
| p-S6抗体 | CST | 4858 | |
| S6抗体 | CST | 2217 | |
| p-CREB抗体 | CST | 9198 | |
| CREB抗体 | CST | 9104 | |
| AR抗体 | CST | 5153 | |
| PSA抗体 | CST | 5365 | |
| RNA提取和qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Fermentas | -- | |
| SYBR GreenER qPCR预混液 | Invitrogen | -- | |
| qRT-PCR | CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | BioRad | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| L-谷氨酰胺 | 文中未明确说明 | -- | |
| 非必需氨基酸 | 文中未明确说明 | -- | |
| HEPES | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素/链霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| shRNA构建体 | Sigma | SHC002, | |
| 嘌呤霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| IC50测定 | CellTiter Blue检测 | Promega | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sigma | C6158 |
| 凋亡检测 | Annexin V Ready Flow试剂 | Thermofisher | R37174 |
| DAPI | 文中未明确说明 | -- | |
| Seahorse assay | 安捷伦 Seahorse XF RPMI培养基 | Agilent | -- |
| 寡霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| FCCP | 文中未明确说明 | -- | |
| 鱼藤酮 | 文中未明确说明 | -- | |
| 异种移植瘤模型 | 基质胶 | Corning | -- |
| ChIP | STAT3抗体 | Cell Signaling | 12,640 |
| IgG抗体 | Thermo Fisher Scientific | 10500C | |
| 蛋白G磁珠 | Life Technologies | -- | |
| LC-MS/MS | ReproSil-Pur C18-AQ 1.9 μm树脂 | Dr. Maisch HPLC GmbH | -- |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-nLC 1000系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 高分辨质谱 | maXis impact质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| Waters Atlantis HILIC硅胶柱 | Waters | -- | |
| Waters Xbridge BEH酰胺柱 | Waters | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型建立 | 小鼠遗传背景（C57BL/6和129/Sv混合）、特定的基因型（Ptenpc−/−Stat3pc−/−、Ptenpc−/−Stat3C/+）、使用的Cre品系（PB-Cre） 阅读提示：Methods: Generation of transgenic mice |
| 细胞培养和处理 | 细胞系（22Rv1、PC3、LNCaP、RWPE-1、MEF）、shRNA克隆号（TRCN0000071456等）、二甲双胍浓度（50μM、5mM等）、处理时间（24h、72h等） 阅读提示：Methods: Cell culture, RNA and qRT-PCR |
| 异种移植瘤实验 | 细胞系（22Rv1、PC3）、接种细胞数（1x10^6）、基质胶比例（1:1）、二甲双胍剂量（50mg/kg）和给药方式（腹腔注射）、治疗天数（PC3为12天，22Rv1为19天） 阅读提示：Methods: Xenograft models in NSG mice |
| ChIP实验 | STAT3抗体（Cat#12640）、IgG对照（Cat#10500C）、甲醛交联时间（10min）、超声条件（30s on/off，15 cycles） 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) |
| LC-MS/MS蛋白质组学 | 小鼠基因型（WT、Ptenpc−/−、Ptenpc−/−Stat3pc−/−、Ptenpc−/−Stat3C/+）、年龄（19周龄）、样本量（n=3）、质谱仪型号（Q Exactive HF）、数据采集参数（梯度、流动相） 阅读提示：Methods: Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC‐MS/MS) |