建立可诱导oncogenic-Dbl的MEF系统并检测GLS上调
验证Rho GTPase信号激活是否上调GLS转录、蛋白和酶活性。
使用tetracycline-off系统控制oncogenic-Dbl表达，撤除doxycycline诱导表达，通过western blot、RT-PCR和线粒体谷氨酰胺酶活性测定检测GLS。
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致癌转录因子c-Jun调控谷氨酰胺酶表达并增敏细胞对谷氨酰胺酶靶向治疗
The oncogenic transcription factor c-Jun regulates glutaminase expression and sensitizes cells to glutaminase-targeted therapy.
实验完整度
高包含可诱导MEF模型、12种乳腺癌细胞系、稳定过表达细胞系及TCGA数据分析，并有ChIP、启动子结合和功能验证
主要模型
可诱导表达oncogenic-Dbl的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 12种人乳腺癌细胞系（包括MDA-MB-231、BT-549、TSE等） 稳定过表达JUN-V5的MDA-MB-468和MCF7衍生细胞系 TCGA乳腺浸润性癌数据集（959个样本）
重点核对
可诱导MEF系统中doxycycline撤除诱导oncogenic-Dbl表达，诱导时间点至72 h 乳腺癌细胞系在含2 mM谷氨酰胺的RPMI 1640+10% FBS中培养至约60%汇合 BPTES处理浓度与IC50测定（如MDA-MB-231 IC50=1.8 μM） JNK抑制剂SP600125使用浓度10–15 μM ChIP使用c-Jun抗体（Cell Signaling Technology 9165）与IgG对照
摘要
许多转化细胞表现出糖代谢改变以及用于合成代谢和生物能量过程的谷氨酰胺利用增加。这些伴随肿瘤发生的代谢适应由致癌信号驱动。在此我们报道，原癌基因JUN的产物转录因子c-Jun是线粒体谷氨酰胺酶（GLS）水平的关键调控因子。致癌Rho GTPase信号下游的c-Jun激活导致GLS基因表达和谷氨酰胺酶活性升高。在人乳腺癌细胞中，GLS蛋白水平和对GLS抑制的敏感性与c-Jun水平强烈相关。我们显示c-Jun直接结合GLS启动子区域，并足以增加基因表达。此外，c-Jun的异位过表达使乳腺癌细胞依赖GLS活性。这些发现揭示了c-Jun作为癌细胞代谢重编程驱动因子的作用，并提示过表达JUN的癌症可能对GLS靶向治疗特别敏感。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 致癌Rho GTPase信号下游如何调控线粒体谷氨酰胺酶（GLS）表达，以及c-Jun在乳腺癌细胞GLS调控和对谷氨酰胺酶靶向治疗敏感性中的作用。
- 核心机制
- 致癌Rho GTPase信号激活MKK4-JNK通路，JNK磷酸化并激活c-Jun；c-Jun直接结合GLS启动子（人GLS转录起始位点−188 bp附近的TGACTCC motif）并增加GLS转录，从而提升谷氨酰胺酶活性并使细胞依赖GLS。
- 主要证据
- 可诱导oncogenic-Dbl的MEF中GLS转录、蛋白和酶活性升高且被JNK抑制剂阻断；12种乳腺癌细胞系中c-Jun与GLS蛋白水平强相关（R=0.85）；ChIP显示c-Jun结合GLS启动子；JUN过表达升高GLS并增敏BPTES；TCGA数据中GLS与c-Jun靶基因转录本相关。
- 研究意义
- 揭示c-Jun作为癌细胞代谢重编程驱动因子，将细胞周期推进与支持增殖的代谢通路联系起来，并提示过表达JUN的癌症（如三阴性乳腺癌）可能对谷氨酰胺酶靶向治疗更敏感。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证转化细胞对谷氨酰胺和GLS活性的依赖
检测oncogenic-Dbl诱导的转化是否依赖外源谷氨酰胺和GLS酶活性。
在含不同浓度谷氨酰胺或BPTES的条件下进行饱和密度、细胞死亡、增殖和锚定非依赖生长实验，并用dimethyl α-KG补救。
鉴定Rho GTPase下游调控GLS的信号通路
确定Rho GTPase下游哪些激酶通路负责上调GLS。
用phospho-specific抗体检测信号通路激活，并用ROCK、p38、JNK、mTORC1和AP-1抑制剂处理诱导细胞，检测GLS蛋白、转录本和酶活性。
验证JNK和c-Jun足以上调GLS
检验JNK和c-Jun是否足以增加GLS表达。
在未诱导MEF中转染组成性激活的MKK/JNK融合构建体或JUN表达构建体，检测GLS转录本和蛋白。
分析乳腺癌细胞系中c-Jun与GLS的相关性及BPTES敏感性
检测人乳腺癌细胞中c-Jun水平与GLS表达及GLS抑制敏感性的关系。
对12种乳腺癌细胞系进行western blot检测c-Jun、phospho-c-Jun、GLS等，并进行6天增殖实验测定BPTES敏感性。
验证c-Jun直接结合GLS启动子
检验c-Jun是否直接结合GLS启动子区域。
在MDA-MB-231细胞中进行ChIP，用c-Jun抗体免疫沉淀c-Jun/DNA复合物，IgG作为阴性对照，RT-PCR扩增GLS启动子−188 bp附近片段。
验证c-Jun调控GLS表达及BPTES敏感性
检验抑制JNK/AP-1或敲低JUN是否降低GLS，以及JUN过表达是否增敏BPTES。
用SP600125、SR11302或JUN siRNA处理乳腺癌细胞检测GLS；在MDA-MB-468和MCF7中稳定过表达JUN-V5，检测GLS表达、酶活性和BPTES敏感性。
分析TCGA乳腺癌数据中GLS与c-Jun靶基因的相关性
在临床肿瘤转录组数据中进一步支持c-Jun活性与GLS表达的关系。
使用cBioportal分析TCGA乳腺浸润性癌数据集，计算GLS mRNA与已验证c-Jun直接靶基因转录本的Spearman相关系数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 无四环素胎牛血清 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 诱导表达 | 多西环素 | -- | -- |
| Western blot | HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
| α/β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2148 | |
| 磷酸化SEK1/MKK4 (S257)抗体 | Cell Signaling Technology | 4514 | |
| 磷酸化MKK7 (S271/T275)抗体 | Cell Signaling Technology | 4171 | |
| 磷酸化JNK (T183/Y185)抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 磷酸化c-Jun (S73)抗体 | Cell Signaling Technology | 3270 | |
| c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| JunB抗体 | Cell Signaling Technology | 3753 | |
| JunD抗体 | Cell Signaling Technology | 5000 | |
| 磷酸化p38 MAPK (T180/Y182)抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 磷酸化ERK1/2 (T202/Y204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 磷酸化肌球蛋白轻链2 (S19)抗体 | Cell Signaling Technology | 3675 | |
| 肌球蛋白轻链2抗体 | Cell Signaling Technology | 3672 | |
| 磷酸化AMPKα (T172)抗体 | Cell Signaling Technology | 4188 | |
| AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2603 | |
| 磷酸化Akt (T308)抗体 | Cell Signaling Technology | 9275 | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 磷酸化p70 S6激酶 (T389)抗体 | Cell Signaling Technology | 9205 | |
| p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9172 | |
| Rb抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| Glut1抗体 | Cell Signaling Technology | 12939 | |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 5605 | |
| GLS抗体 | Abgent | AP8809b | |
| MKK4 (MEK4)抗体 | Abcam | ab33912 | |
| MKK7 (MEK7)抗体 | Abcam | ab52618 | |
| 磷酸化c-Myc (T58+S62)抗体 | Abcam | ab10568 | |
| JNK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-571 | |
| GLUD1/2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-160383 | |
| V5标签抗体 | Life Technologies | R960 | |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| HRP标记驴抗山羊IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2020 | |
| 药物处理 | BPTES | -- | -- |
| Y-27632 | Calbiochem | -- | |
| SP600125 | Calbiochem | -- | |
| G418 | Calbiochem | -- | |
| 线粒体分离 | Qproteome线粒体分离试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 谷氨酰胺酶活性测定 | 牛肝谷氨酸脱氢酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| RT-PCR | RNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| SuperScript III第一链合成系统 | Life Technologies | -- | |
| 7500快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| POWER SYBR green PCR预混液 | Life Technologies | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| RNA干扰 | Silencer select预制验证siRNA | Life Technologies | s7658, s7659 |
| Silencer select阴性对照siRNA | Life Technologies | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 质粒构建 | pCDNA3.1/V5-His TOPO载体 | Life Technologies | -- |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| BamH1限制酶 | New England Biolabs | -- | |
| EcoRV限制酶 | New England Biolabs | -- | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | -- | |
| Western blot | Bradford测定 | Bio-Rad | -- |
| Novex 4–20% Tris-glycine迷你或中型蛋白凝胶 | Life Technologies | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | PerkinElmer | -- | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | -- | |
| HyBlot ES放射自显影胶片 | Denville Scientific Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 可诱导MEF系统 | doxycycline浓度0.6 μg ml−1用于抑制表达；撤除后诱导时间点至72 h；DMEM含4 mM谷氨酰胺和10%无四环素FBS 阅读提示：Methods 'Isogenic inducible MEF system for oncogenic-Dbl expression' |
| 乳腺癌细胞系培养 | RPMI 1640含2 mM谷氨酰胺和10% FBS；谷氨酰胺撤除实验使用无谷氨酰胺RPMI+10%透析FBS；细胞收集于约60%汇合 阅读提示：Methods 'Breast cancer cell culture and media' |
| BPTES敏感性增殖实验 | BPTES浓度范围及IC50<10 μM定义高敏感；细胞接种密度因细胞系而异；培养6天；triplicate 阅读提示：Methods 'Cell proliferation assays'及Figure 5 legend |
| ChIP检测c-Jun结合GLS启动子 | MDA-MB-231细胞5×15 cm dishes约85%汇合；染色质消化至150–900 bp；c-Jun抗体Cell Signaling Technology 9165；兔IgG阴性对照；三组引物扩增−188 bp附近片段 阅读提示：Methods 'Chromatin immunoprecipitation'及Figure 5a legend |
| JUN稳定过表达细胞系 | MDA-MB-468和MCF7转染pCDNA3.1或pCDNA3.1-JUN；G418筛选浓度MCF7 500 μg ml−1、MDA-MB-468 800 μg ml−1；维持浓度250 μg ml−1 阅读提示：Methods 'Stable cell lines' |