病理进展特征引导的双相药物递送超分子水凝胶用于骨关节炎协同软骨保护

Pathological progression features-guided biphasic drug delivery supramolecular hydrogel for synergistic cartilage protection in osteoarthritis

作者信息Juntao Lin, Rulong Cai, Shaobing Li, Zhixiang Peng, Yupeng Wang, Yan Chen, Dongfang Zhou

PMID42979080

期刊Acta Pharm Sin B

发布时间2026-11

DOI10.1016/j.apsb.2026.03.032

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实验完整度

高

包含生物信息学分析、体外细胞实验、共培养体系及大鼠OA模型体内验证，并进行了功能与机制验证

主要模型

RAW264.7巨噬细胞原代软骨细胞 Transwell共培养体系胶原酶诱导的大鼠OA模型

重点核对

大鼠OA模型：30只雄性SD大鼠，随机分为5组，每组6只， collagenase VII注射造模，第1周和第4周关节腔注射50 μL PBS、DS@cLip（DS: 2.5 μg/kg）、SP Gel（SP: 0.05 mg/kg）或SP Gel/DS@cLip（SP: 0.05 mg/kg; DS: 2.5 μg/kg）体外巨噬细胞极化：RAW264.7细胞经100 ng/mL LPS预孵育6 h，水凝胶提取物处理12 h，流式检测iNOS和CD206 体外软骨细胞焦亡：原代软骨细胞经LPS/NIG诱导焦亡，透析液干预，检测GSDMD-N和LDH 水凝胶表征：流变学测试频率0.1–100 rpm、应变1%；自愈合交替应变1%和500%；摩擦测试振幅4 mm、频率1 Hz、时间600 s 药物释放：透析袋（MWCO 3500 Da）在PBS或1 mmol/L H2O2中37 °C振荡，HPLC检测DS，茚三酮法检测SP

摘要

骨关节炎（OA）由于其复杂的发病机制以及目前缺乏能够阻止软骨进行性退化的有效疗法，仍然是主要的临床挑战。我们的生物信息学分析显示，在早期OA中滑膜炎症先于软骨退变，而软骨细胞焦亡在早期和晚期均存在，进一步促进软骨退化。基于这些发现，我们开发了一种新型病理进展引导的双相药物递送超分子水凝胶（SP Gel/DS@cLip），其特征是双交联，其中亚精胺（SP）和负载双硫仑（DS）的阳离子脂质体（DS@cLip）均积极参与水凝胶网络形成。SP Gel/DS@cLip表现出良好的可注射性、自愈合能力、润滑性能和生物相容性。值得注意的是，该水凝胶系统能够快速释放SP以靶向早期滑膜炎症，并持续释放DS以抑制软骨细胞焦亡，在体外和体内均发挥显著的软骨保护作用。这种病理进展特征引导的双相药物递送系统为OA治疗提供了一种有前景的治疗方法，具有强大的临床转化潜力。

生物信息学分析及动物模型验证OA病理进展特征

探究OA进展中滑膜炎症与软骨细胞焦亡的时序关系

分析scRNA-seq数据集GSE220243、GSE176308、GSE152805和bulk RNA-seq数据集GSE114007，进行UMAP聚类、伪时间分析、GO/KEGG富集、PPI网络分析；构建大鼠CIOA模型，在Day 7和Day 28进行组织学染色验证

双相药物递送超分子水凝胶的制备与表征

构建具有可注射性、自愈合、润滑和ROS响应释放性能的水凝胶系统

制备DS@cLip阳离子脂质体，与HA-PBA和SP混合形成B–N配位交联水凝胶；检测zeta电位、粒径、TEM形态、流变学、SEM、可注射性、自愈合、摩擦系数、ROS响应降解和药物释放

体外早期滑膜抗炎效果评价

验证SP Gel/DS@cLip快速释放SP对巨噬细胞极化的调控作用

RAW264.7巨噬细胞经LPS刺激后，用水凝胶提取物（Day 1、4、7）处理，流式检测M1/M2标志物，Western blot检测CD86、ARG1、p-P65，ELISA检测炎症因子

体外持续抗软骨细胞焦亡效果评价

验证SP Gel/DS@cLip持续释放DS对软骨细胞焦亡的抑制作用

原代软骨细胞经LPS/NIG诱导焦亡，用DS@cLip或SP Gel/DS@cLip透析液（Day 1、4、7、14、21、28）干预，检测GSDMD-N活性、LDH释放、焦亡相关蛋白表达

共培养体系评价协同软骨保护效果

验证双相释放SP和DS对巨噬细胞和软骨细胞的协同调控作用

LPS刺激的巨噬细胞与LPS/NIG诱导的软骨细胞在Transwell体系中共培养，用水凝胶提取物（Day 1、4、21）处理，检测M1比例、GSDMD-N活性、焦亡蛋白、COL II/MMP3/MMP13表达及ECM分泌

大鼠OA模型体内药效评价

验证SP Gel/DS@cLip在体内的双相释放行为和软骨保护效果

大鼠CIOA模型造模后第1周和第4周关节腔注射PBS、DS@cLip、SP Gel或SP Gel/DS@cLip，第7周处死，进行组织学染色、OARSI评分、GAG含量测定、免疫组化和免疫荧光分析

体内双相释放行为可视化

验证SP和DS在体内的双相释放动力学

将Cy5（模拟SP）和IR780（模拟DS）标记的水凝胶注射到大鼠关节腔，用IVIS Spectrum进行4周活体成像

实验环节	名称	品牌	货号
脂质体制备	胆固醇	Aladdin	C476640
卵磷脂	Aladdin	L426059
十八胺	Aladdin	O108436
药物处理	双硫仑	Sigma–Aldrich	97-77-8
硫酸链霉素	Sigma–Aldrich	3810-74-0
大鼠OA模型	胶原酶VII	Sigma–Aldrich	9001-12-1
细胞刺激	脂多糖	Sigma–Aldrich	93572-42-0
尼日利亚菌素	Sigma–Aldrich	28380-24-7
水凝胶制备	透明质酸	Bidepharm	H131007
亚精胺	Bidepharm	S107071
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺	Mreda	M042869
羟基苯并三唑	Mreda	M109756
细胞培养	磷酸盐缓冲液	Gibco	10010023
Dulbecco改良Eagle培养基	Gibco	11965092
胎牛血清	Gibco	A5256701
ROS检测	2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯	Solarbio	D6470
软骨细胞分离	胶原酶II	Solarbio	C8150
细胞毒性检测	活/死细胞染色试剂盒	Beyotime	C1070S-2
细胞活力检测	细胞计数试剂盒-8	Beyotime	C0041
流式分析	PE-iNOS抗体	BioLegend	696805
APC-CD206抗体	BioLegend	321109
蛋白提取	RIPA裂解液	Beyotime	P0038-1
蛋白定量	BCA蛋白定量试剂盒	Beyotime	P0012S
Western blot	抗CD86抗体	Proteintech	13395-1-AP
抗ARG1抗体	Santa Cruz	sc-271430
抗磷酸化P65抗体	Cell Signaling Technology	3033
抗P65抗体	Abmart	T55034
抗GAPDH抗体	Proteintech	CL594-60004
ELISA	IL-6检测试剂盒	mmbio	1011M1
TNF-α检测试剂盒	Beyotime	PT512
TGF-β检测试剂盒	mmbio	46344M2
IL-10检测试剂盒	NJBYBIO	BYGR500005
GSDMD-N ELISA试剂盒	MMBIO	45633M2
免疫荧光	抗NLRP3抗体	affinity	DF7438
抗Cleaved caspase 1抗体	affinity	AF4005
抗Cleaved GSDMD抗体	affinity	AF4012
抗COL II抗体	Proteintech	28459-1-AP
抗MMP13抗体	Proteintech	18165-1-AP
Western blot	抗TUBULIN抗体	affinity	AF7011
蛋白分子量标准（10–180 kDa）	Biosharp	BL712A
免疫组化	抗TNF-α抗体	Cell Signaling Technology	3707
TUNEL实验	TUNEL检测试剂盒	Beyotime	C1176S
药物释放	透析袋（截留分子量3500 Da）	Sigma–Aldrich	--
SP检测	茚三酮试剂	Aladdin	N100253
摩擦测试	聚乙烯球（直径8 mm）	Nanjing Qunlong Glass	QP008
流变学测试	旋转流变仪	Anton Paar	MCR 302
形貌观察	扫描电子显微镜	Hitachi	SU8220
摩擦测试	通用材料试验机	Bruker-CETR	UMT-2
DS检测	高效液相色谱仪	Wookinglab	K2025
吸光度检测	酶标仪	Thermo Fisher Scientific	--
活体成像	IVIS Spectrum活体成像系统	PerkinElmer	--
荧光检测	荧光显微镜	--	LSM 880

实验环节

名称

品牌

货号

脂质体制备

胆固醇

Aladdin

C476640

卵磷脂

Aladdin

L426059

十八胺

Aladdin

O108436

药物处理

双硫仑

Sigma–Aldrich

97-77-8

硫酸链霉素

Sigma–Aldrich

3810-74-0

大鼠OA模型

胶原酶VII

Sigma–Aldrich

9001-12-1

细胞刺激

脂多糖

Sigma–Aldrich

93572-42-0

尼日利亚菌素

Sigma–Aldrich

28380-24-7

水凝胶制备

透明质酸

Bidepharm

H131007

亚精胺

Bidepharm

S107071

1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

Mreda

M042869

羟基苯并三唑

Mreda

M109756

细胞培养

磷酸盐缓冲液

Gibco

10010023

Dulbecco改良Eagle培养基

Gibco

11965092

胎牛血清

Gibco

A5256701

ROS检测

2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯

Solarbio

D6470

软骨细胞分离

胶原酶II

Solarbio

C8150

细胞毒性检测

活/死细胞染色试剂盒

Beyotime

C1070S-2

细胞活力检测

细胞计数试剂盒-8

Beyotime

C0041

流式分析

PE-iNOS抗体

BioLegend

696805

APC-CD206抗体

BioLegend

321109

蛋白提取

RIPA裂解液

Beyotime

P0038-1

蛋白定量

BCA蛋白定量试剂盒

Beyotime

P0012S

Western blot

抗CD86抗体

Proteintech

13395-1-AP

抗ARG1抗体

Santa Cruz

sc-271430

抗磷酸化P65抗体

Cell Signaling Technology

3033

抗P65抗体

Abmart

T55034

抗GAPDH抗体

Proteintech

CL594-60004

ELISA

IL-6检测试剂盒

mmbio

1011M1

TNF-α检测试剂盒

Beyotime

PT512

TGF-β检测试剂盒

mmbio

46344M2

IL-10检测试剂盒

NJBYBIO

BYGR500005

GSDMD-N ELISA试剂盒

MMBIO

45633M2

免疫荧光

抗NLRP3抗体

affinity

DF7438

抗Cleaved caspase 1抗体

affinity

AF4005

抗Cleaved GSDMD抗体

affinity

AF4012

抗COL II抗体

Proteintech

28459-1-AP

抗MMP13抗体

Proteintech

18165-1-AP

Western blot

抗TUBULIN抗体

affinity

AF7011

蛋白分子量标准（10–180 kDa）

Biosharp

BL712A

免疫组化

抗TNF-α抗体

Cell Signaling Technology

3707

TUNEL实验

TUNEL检测试剂盒

Beyotime

C1176S

药物释放

透析袋（截留分子量3500 Da）

Sigma–Aldrich

SP检测

茚三酮试剂

Aladdin

N100253

摩擦测试

聚乙烯球（直径8 mm）

Nanjing Qunlong Glass

QP008

流变学测试

旋转流变仪

Anton Paar

MCR 302

形貌观察

扫描电子显微镜

Hitachi

SU8220

摩擦测试

通用材料试验机

Bruker-CETR

UMT-2

DS检测

高效液相色谱仪

Wookinglab

K2025

吸光度检测

酶标仪

Thermo Fisher Scientific

活体成像

IVIS Spectrum活体成像系统

PerkinElmer

荧光检测

荧光显微镜

LSM 880

环节	核对要点
大鼠OA模型构建与给药	大鼠品系、性别、周龄、样本量（30只雄性SD大鼠，6–7周龄，随机分5组每组6只）；造模方式（胶原酶VII注射第1天和第3天）；给药时间（第1周和第4周）；给药剂量（DS@cLip: DS 2.5 μg/kg；SP Gel: SP 0.05 mg/kg；SP Gel/DS@cLip: SP 0.05 mg/kg + DS 2.5 μg/kg）；给药体积（50 μL关节腔注射）；观察终点（第7周处死）阅读提示：Methods 2.7节和Figure 6A
体外巨噬细胞极化实验	细胞系（RAW264.7）；刺激条件（100 ng/mL LPS预孵育6 h）；水凝胶提取物处理时间（12 h）；提取物浓度（DS@cLip: DS 10 μg/mL；SP Gel: SP 0.2 mg/mL；SP Gel/DS@cLip: SP 0.2 mg/mL + DS 10 μg/mL）；检测指标（iNOS/CD206流式、CD86/ARG1/p-P65 Western blot、IL-6/TNF-α/NO/TGF-β/IL-10 ELISA）阅读提示：Methods 2.4节和Figure 3
体外软骨细胞焦亡实验	细胞类型（原代软骨细胞）；焦亡诱导条件（LPS/NIG）；透析液收集时间点（DS@cLip: Day 1、4、7；SP Gel/DS@cLip: Day 1、4、7、14、21、28）；干预时间（24 h）；检测指标（GSDMD-N ELISA、LDH释放、NLRP3/cleaved caspase 1/cleaved GSDMD/IL-18蛋白表达）阅读提示：Methods 2.5节和Figure 4
共培养体系实验	共培养方式（Transwell体系）；细胞刺激条件（巨噬细胞LPS刺激12 h，软骨细胞LPS/NIG刺激12 h）；共培养时间（12 h）；水凝胶提取物处理时间（24 h）；提取物时间点（Day 1、4、21）；检测指标（M1比例、GSDMD-N活性、焦亡蛋白、COL II/MMP3/MMP13、番红O染色、CCK-8、PI染色）阅读提示：Methods 2.6节和Figure 5
水凝胶制备与表征	HA-PBA和SP浓度（50 mg HA-PBA + 60 mg SP溶于1 mL PBS）；混合比例（5:1 v:v）；凝胶化条件（3 min at 25 °C）；流变学测试参数（频率0.1–100 rpm，应变1%）；自愈合测试（交替应变1%和500%，各60 s）；摩擦测试参数（振幅4 mm，频率1 Hz，时间600 s）阅读提示：Methods 2.3节和Figure 2
体内双相释放成像	动物数量（3只雄性SD大鼠，6–7周龄）；标记物（Cy5模拟SP，IR780模拟DS）；成像时间点（Day 1、3、7、14、21、28）阅读提示：Methods 2.8节和Figure 6B–C

环节

核对要点

大鼠OA模型构建与给药

大鼠品系、性别、周龄、样本量（30只雄性SD大鼠，6–7周龄，随机分5组每组6只）；造模方式（胶原酶VII注射第1天和第3天）；给药时间（第1周和第4周）；给药剂量（DS@cLip: DS 2.5 μg/kg；SP Gel: SP 0.05 mg/kg；SP Gel/DS@cLip: SP 0.05 mg/kg + DS 2.5 μg/kg）；给药体积（50 μL关节腔注射）；观察终点（第7周处死）

阅读提示：Methods 2.7节和Figure 6A

体外巨噬细胞极化实验

细胞系（RAW264.7）；刺激条件（100 ng/mL LPS预孵育6 h）；水凝胶提取物处理时间（12 h）；提取物浓度（DS@cLip: DS 10 μg/mL；SP Gel: SP 0.2 mg/mL；SP Gel/DS@cLip: SP 0.2 mg/mL + DS 10 μg/mL）；检测指标（iNOS/CD206流式、CD86/ARG1/p-P65 Western blot、IL-6/TNF-α/NO/TGF-β/IL-10 ELISA）

阅读提示：Methods 2.4节和Figure 3

体外软骨细胞焦亡实验

细胞类型（原代软骨细胞）；焦亡诱导条件（LPS/NIG）；透析液收集时间点（DS@cLip: Day 1、4、7；SP Gel/DS@cLip: Day 1、4、7、14、21、28）；干预时间（24 h）；检测指标（GSDMD-N ELISA、LDH释放、NLRP3/cleaved caspase 1/cleaved GSDMD/IL-18蛋白表达）

阅读提示：Methods 2.5节和Figure 4

共培养体系实验

共培养方式（Transwell体系）；细胞刺激条件（巨噬细胞LPS刺激12 h，软骨细胞LPS/NIG刺激12 h）；共培养时间（12 h）；水凝胶提取物处理时间（24 h）；提取物时间点（Day 1、4、21）；检测指标（M1比例、GSDMD-N活性、焦亡蛋白、COL II/MMP3/MMP13、番红O染色、CCK-8、PI染色）

阅读提示：Methods 2.6节和Figure 5

水凝胶制备与表征

HA-PBA和SP浓度（50 mg HA-PBA + 60 mg SP溶于1 mL PBS）；混合比例（5:1 v:v）；凝胶化条件（3 min at 25 °C）；流变学测试参数（频率0.1–100 rpm，应变1%）；自愈合测试（交替应变1%和500%，各60 s）；摩擦测试参数（振幅4 mm，频率1 Hz，时间600 s）

阅读提示：Methods 2.3节和Figure 2

体内双相释放成像

动物数量（3只雄性SD大鼠，6–7周龄）；标记物（Cy5模拟SP，IR780模拟DS）；成像时间点（Day 1、3、7、14、21、28）

阅读提示：Methods 2.8节和Figure 6B–C

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