胚胎及体外分化系统中mRNA稳定性分析
检测早期胚胎发育和体外分化过程中mRNA稳定性的整体变化及与PrE谱系的关系
对小鼠8细胞期至囊胚期及TBLCs/EPSCs分化过程进行RNA-seq，采用EISA和放线菌素D转录抑制实验测定mRNA稳定性及半衰期
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
关键转录因子mRNA稳定性的表观转录组调控调节第二次细胞命运决定
Epitranscriptomic regulation of mRNA stability in pivotal transcription factors modulates the second cell fate decision.
实验完整度
高包含体内小鼠胚胎、TBLCs/EPSCs/mESCs体外模型、类囊胚，并有敲低/敲除、m6A位点编辑及稳定性检测等功能与机制验证
主要模型
小鼠体内胚胎（E3.5-E4.5） 小鼠TBLCs及diffTBLCs 小鼠EPSCs及PrE-diff细胞 EPSC来源类囊胚
重点核对
TBLCs向diffTBLCs分化：Serum/Lif培养基培养3天，1:6传代 EPSCs PrE诱导：N2B27+CHIR99021+FGF4+视黄酸+8Br-cAMP，Virma/Mettl3 cKO加1 μg/mL 4-OHT处理48 h 胚胎基因敲除：合子注射100 ng/μL Cas9 mRNA和50 ng/μL每种sgRNA mRNA稳定性检测：放线菌素D 10 μg/mL处理0、1、2、3 h 类囊胚形成：EPSCs与GBL-1细胞各4000个/孔于Aggrewell中培养3或5天
摘要
胚胎发育需要转录和转录后机制的精确协调，以确保快速的细胞命运转换，然而RNA如何影响这些转换的分子机制仍不清楚。在这里，我们观察到在囊胚形成期间mRNA稳定性整体增加，这发生在快速谱系特化之前。利用体内和小鼠全能性卵裂球样细胞（TBLCs）或扩展多能干细胞（EPSCs）分化系统，我们证明这种转录组范围的稳定化对于第二次细胞命运决定至关重要，特别是在原始内胚层（PrE）的形成中。机制上，甲基转移酶复合物（MTC）的组分VIRMA和METTL3通过N6-甲基腺苷（m6A）阅读蛋白IGF2BP3稳定关键的PrE转录因子（包括Gata6），从而建立谱系特化。敲低这些调节蛋白或靶向去除Gata6上的m6A，在体内和体外均影响PrE的分化，并导致囊胚形成和类囊胚形成的缺陷。我们的结果表明，m6A依赖的转录后调控在围植入期塑造谱系特化中发挥关键作用，并为挽救发育缺陷提供了潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 第二次细胞命运决定期间，RNA稳定性及m6A修饰如何调控原始内胚层（PrE）谱系特化？
- 核心机制
- VIRMA和METTL3介导PrE关键转录因子（如Gata6）转录本上的m6A修饰，被阅读蛋白IGF2BP3识别，增强mRNA稳定性并维持蛋白表达，从而促进PrE分化。
- 主要证据
- 小鼠胚胎、TBLCs、EPSCs和mESCs中敲低/敲除Virma或Mettl3降低PrE细胞比例和Gata6 mRNA稳定性；dCas13b-FTO靶向去除Gata6 m6A位点重现PrE分化缺陷；RIP-qPCR显示IGF2BP3结合Gata6 m6A修饰的3'UTR。
- 研究意义
- 将m6A介导的转录后稳定性控制定位为第二次细胞命运决定的上游关键调控层，为挽救发育缺陷提供了潜在策略，并对干细胞工程具有广泛意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MTC组分在体外PrE分化中的功能验证
验证VIRMA和METTL3对PrE样细胞分化的调控作用
在TBLCs中使用siRNA敲低Virma或Mettl3，在EPSCs和mESCs中使用条件敲除系统，通过流式细胞术、免疫荧光、qRT-PCR和RNA-seq检测PrE标志物和细胞比例
体内胚胎中MTC组分的功能验证
验证VIRMA和METTL3在小鼠胚胎PrE谱系发育中的作用
通过合子注射Cas9 mRNA和sgRNA构建Virma或Mettl3敲除胚胎，在E4.5进行免疫荧光染色和细胞计数
m6A修饰对PrE基因mRNA稳定性的调控验证
验证VIRMA依赖的m6A修饰是否维持PrE特异性基因的mRNA稳定性
对Virma敲低的TBLCs进行GLORI、放线菌素D稳定性分析和m6A-IP-qPCR，检测Gata6等基因的m6A水平与mRNA半衰期
Gata6 m6A位点靶向去除的功能验证
验证Gata6上特定m6A位点对其mRNA稳定性和PrE分化的直接作用
利用dCas13b-wtFTO和sgRNA靶向去除Gata6 m6A位点，通过SELECT、m6A-IP-qPCR、放线菌素D半衰期测定、流式细胞术和免疫荧光评估PrE分化及类囊胚形成
m6A阅读蛋白IGF2BP3的鉴定与功能验证
鉴定调控PrE基因mRNA稳定性的m6A阅读蛋白并验证其功能
通过RNA-seq数据分析筛选IGF2BPs，在TBLCs、EPSCs和mESCs中敲低Igf2bp3，利用流式细胞术、qRT-PCR、放线菌素D稳定性分析和RIP-qPCR验证其对PrE分化和Gata6稳定性的影响
体内Igf2bp3敲低对PrE发育的影响
验证IGF2BP3在小鼠胚胎PrE谱系发育中的作用
向2细胞期胚胎注射Igf2bp3 siRNA，在E4.5进行免疫荧光和细胞计数
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠超数排卵 | 孕马血清促性腺激素 | San-Sheng Pharmaceutical | -- |
| 人绒毛膜促性腺激素 | San-Sheng Pharmaceutical | -- | |
| 胚胎培养 | G-1 PLUS培养基 | Vitrolife | 10128 |
| 类囊胚形成 | Aggrewell微孔板 | Stemcell technologies | 34811 |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| 超低吸附多孔板 | Corning | 3471 | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | GIBCO | 11965 |
| 胎牛血清 | Gemini | 900-108 | |
| L-谷氨酰胺 | Millipore | 25030-081 | |
| 非必需氨基酸 | Millipore | TSM-001-C | |
| 类囊胚培养 | CMRL 1066培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11530037 |
| N2添加剂 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Invitrogen | 17504-044 | |
| 细胞传代 | 0.05%胰蛋白酶 | GIBCO | 25300062 |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | GIBCO | 15140163 |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO | 25030081 | |
| 非必需氨基酸 | GIBCO | 11140050 | |
| 小鼠白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| CHIR99021 | Selleck | S1263 | |
| (S)-(+)-二甲基马来酸 | Tocris | 1425 | |
| 盐酸米诺环素 | Selleck | S4226 | |
| DMEM/F-12培养基 | GIBCO | 11330032 | |
| Neurobasal培养基 | GIBCO | 21103049 | |
| N2添加剂 | Invitrogen | 17502048 | |
| KnockOut血清替代物 | GIBCO | 10828028 | |
| 条件敲除诱导 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | SML1666 |
| PrE诱导 | 重组人FGF4 | PeproTech | 100-31 |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | |
| 8-溴-cAMP | Selleck | S7857 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | 13778100 |
| Opti-MEM培养基 | GIBCO | 31985070 | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 11668019 |
| 体外转录 | MEGAshortscript T7转录试剂盒 | Invitrogen | AM1354 |
| mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA转录试剂盒 | Invitrogen | AM1345 | |
| 免疫荧光 | 抗VIRMA抗体 | Proteintech | 25712-1-AP |
| 抗METTL3抗体 | Abcam | ab195352 | |
| 抗OCT4抗体 | Abcam | ab184665 | |
| 抗SOX17抗体 | R&D | AF1924-SP | |
| 小鼠抗CDX2抗体 | Bio-Genex | MU392A-UC | |
| 抗GATA6抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 5851 | |
| Alexa Fluor 488/594/抗山羊647/抗兔647偶联物 | Thermo Fisher | A-11055/A-11005/A-21447/A-31537 | |
| Western blot | HRP偶联GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | HRP-60004 |
| 抗小鼠IgG HRP偶联抗体 | CST | 7073 | |
| 抗兔IgG HRP偶联抗体 | CST | 7074 | |
| 流式细胞术 | APC抗小鼠CD140a抗体 | BioLegend | 135907 |
| RIP | 抗IGF2BP3抗体 | CST | 25864 |
| 抗YTHDF2抗体 | Abcam | ab246514 | |
| MeRIP | 抗N6-甲基腺苷抗体 | New England Biolabs | E1610S |
| 免疫荧光 | 0.2%明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| DAPI | Solarbio | C0065 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| 6×蛋白上样缓冲液 | Transgen | DL101-02 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH07850 | |
| 增强化学发光试剂 | Meilunbio | MA0187 | |
| Blue Plus IV蛋白Marker（10–180 kDa） | Transgen | DM131-01 | |
| Blue Plus V蛋白Marker（10–190 kDa） | Transgen | DM141-01 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| HiScript IIQRT SuperMix for qPCR | Vazyme | R223 | |
| Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q712 | |
| SELECT qPCR | SplintR连接酶 | NEB | M0375S |
| RNA-seq | SMARTer链特异性总RNA-seq试剂盒v.2 | Takara | 634413 |
| VAHTS Universal v.8 RNA-seq文库构建试剂盒（Illumina） | Vazyme | NR605 | |
| 类囊胚收集 | 链霉蛋白酶E | Millipore | 107433 |
| GLORI文库构建 | Dynabeads Oligo (dT)25 | Invitrogen | 61002 |
| 片段化缓冲液 | NEB | E6150S | |
| 乙二醛溶液 | Sigma-Aldrich | 50649 | |
| 饱和硼酸 | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| mRNA稳定性分析 | ERCC RNA spike-in对照 | Invitrogen | 4456740 |
| RIP | 蛋白A/G磁珠 | Thermo | 88846, 88848 |
| MeRIP | EpiMark® N6-甲基腺苷富集试剂盒 | NEB | E1610S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TBLCs向diffTBLCs分化 | 接种密度（1:6传代）、Serum/Lif培养基成分、分化时间3天 阅读提示：Methods中Cell culture and differentiation小节 |
| EPSCs PrE诱导及条件敲除 | PrE诱导培养基成分（CHIR99021 3 μmol/L、FGF4 100 ng/mL、视黄酸10 nmol/L、8Br-cAMP 1 mmol/L）、4-OHT浓度1 μg/mL及处理48 h 阅读提示：Methods中Cell culture and differentiation小节 |
| 胚胎基因敲除 | 合子注射Cas9 mRNA 100 ng/μL和每种sgRNA 50 ng/μL、胚胎培养至E4.5、免疫荧光抗体稀释比例 阅读提示：Methods中Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA to mouse zygotes via microinjection小节 |
| mRNA稳定性检测 | 放线菌素D浓度10 μg/mL、收集时间点0、1、2、3 h、ERCC spike-in加入量0.1 μL/样本 阅读提示：Methods中RNA-seq for mRNA stability profiling小节 |
| 类囊胚形成 | EPSCs与GBL-1细胞各4000个/孔、Aggrewell 34811、Y-27632 10 μM、培养3或5天 阅读提示：Methods中Embryoid production小节 |
| dCas13b-FTO靶向m6A去除 | sgGata6-1和sgGata6-2序列、dCas13b-wtFTO与mutFTO对照、病毒感染48 h后mCherry阳性分选 阅读提示：Methods中CRISPR-dCas13b stable cell-line generation小节及Supplementary Data 1 |