肥胖状态下脂肪组织TRPM7表达与通道活性检测
验证TRPM7在肥胖脂肪组织中是否上调并具有功能活性。
检测HFD与CD喂养小鼠eWAT和iWAT中TRPM7的mRNA和蛋白水平，并用膜片钳记录新鲜分离脂肪细胞的TRPM7电流及FTY720敏感性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
阳离子通道TRPM7的脂肪组织特异性缺失抑制雄性小鼠中TAK1激酶依赖性炎症和肥胖
Adipose-specific deletion of the cation channel TRPM7 inhibits TAK1 kinase-dependent inflammation and obesity in male mice.
实验完整度
高包含脂肪细胞特异性敲除小鼠、体外原代脂肪细胞、AAV局部敲除/过表达及FTY720药理学干预，并有功能与机制验证。
主要模型
脂肪细胞特异性TRPM7敲除（ATKO）小鼠 高脂饮食喂养的C57BL/6J雄性小鼠 原代附睾脂肪细胞及SVF分化脂肪细胞 3T3-L1脂肪细胞和HEK293T细胞
重点核对
ATKO小鼠由TRPM7fl/fl与Adipoq-Cre杂交构建，仅成年雄性小鼠用于实验 HFD（60% kcal fat，D12492）或CD（10% kcal fat，D12450J）喂养16周 FTY720口服给药剂量为3 mg/kg/天，持续8周 TNF-α刺激脂肪细胞的常用浓度为60 ng/ml处理15 min（部分实验40 ng/ml处理12 h） 胰岛素刺激实验使用0.75 U/kg腹腔注射，GTT使用1 g/kg葡萄糖
摘要
白色脂肪组织的慢性炎症是肥胖与相关代谢综合征之间的关键联系。瞬时受体电位melastatin样7（TRPM7）已知与炎症相关；然而，TRPM7在肥胖中脂肪细胞表型和功能的作用尚不清楚。在此，我们观察到脂肪细胞TRPM7的激活在促炎反应中发挥重要作用。我们的实验使用成年雄性小鼠。脂肪细胞特异性TRPM7缺失减弱促炎表型，改善葡萄糖稳态，并抑制高脂饮食喂养小鼠的体重增加。机制上，TRPM7的促炎作用依赖于Ca2+信号。TRPM7引发的Ca2+内流通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II和肿瘤坏死因子受体相关因子6的共同调节增强转化生长因子-β激活激酶1的激活，导致核因子kappa B信号加剧。此外，用TRPM7抑制剂治疗的肥胖小鼠免受肥胖和胰岛素抵抗的保护。我们的结果证明TRPM7是脂肪炎症发展的一个因素，在肥胖中调节胰岛素敏感性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRPM7在肥胖诱导的脂肪组织炎症和脂肪细胞功能中发挥什么作用及其机制是什么？
- 核心机制
- TRPM7通道介导的Ca2+内流通过CaMKII和TRAF6协同促进TAK1 K63泛素化与磷酸化激活，进而增强NF-κB信号和促炎基因表达；c-Cbl可能作为Ca2+传感器参与调控TRAF6-TAK1复合物形成。
- 主要证据
- 脂肪细胞特异性TRPM7敲除小鼠在高脂饮食下体重增加减少、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性改善、脂肪组织炎症和巨噬细胞浸润减轻；体外原代脂肪细胞中TRPM7缺失或FTY720抑制降低TNF-α诱导的Ca2+内流、TAK1-NF-κB活化和炎症基因表达；AAV介导eWAT中TAK1过表达可部分逆转TRPM7敲除的保护效应；FTY720口服改善肥胖小鼠代谢。
- 研究意义
- 研究提示脂肪细胞TRPM7是连接肥胖、脂肪炎症和胰岛素抵抗的重要调节因子，可能作为肥胖及相关代谢紊乱的潜在药理靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂肪细胞特异性TRPM7敲除小鼠构建与代谢表型分析
确定脂肪细胞TRPM7缺失对饮食诱导肥胖和代谢稳态的影响。
将TRPM7fl/fl与Adipoq-Cre杂交获得ATKO小鼠，给予CD或HFD 16周，检测体重、脂肪重量、micro-CT脂肪分布、血清TG/FFA、代谢笼参数和摄食量。
葡萄糖稳态和胰岛素敏感性评估
验证脂肪细胞TRPM7缺失对HFD诱导的全身胰岛素抵抗的影响。
检测空腹血糖和胰岛素、GTT、ITT，以及胰岛素刺激后eWAT、肝脏和骨骼肌中IRS-1/IR/Akt磷酸化。
脂肪组织炎症和巨噬细胞浸润分析
确定TRPM7缺失是否减轻HFD诱导的脂肪炎症。
对eWAT进行RNA-seq和qPCR检测炎症基因，ELISA检测循环炎症因子，F4/80免疫组化和FACS检测巨噬细胞浸润，Western blot检测NF-κB通路。
脂肪细胞TRPM7缺失的细胞自主性验证
判断TRPM7对NF-κB信号的调控是否为脂肪细胞自主效应。
分离培养Flox和ATKO小鼠eWAT原代脂肪细胞，分化后以TNF-α刺激，检测NF-κB通路磷酸化、炎症基因表达和MCP-1分泌，并检测条件培养基对巨噬细胞趋化的影响。
AAV介导的eWAT急性TRPM7敲除验证
排除体重减轻对炎症表型的混杂影响。
对HFD喂养12周的Flox小鼠双侧eWAT注射AAV-Vec或AAV-Adipoq-Cre，4周后检测脂肪细胞TRPM7敲除、炎症、NF-κB和胰岛素信号。
TRPM7依赖性Ca2+信号验证
确定TRPM7是否通过Ca2+内流调控脂肪细胞炎症。
用Fluo-4 AM钙成像检测TRPM7敲除或FTY720对TNF-α诱导的[Ca2+]i升高的影响；用BAPTA-AM螯合细胞内Ca2+，检测NF-κB通路和炎症基因。
TAK1在TRPM7促炎信号中的作用验证
明确TAK1是否为TRPM7-Ca2+信号下游的关键节点。
检测HFD和TNF-α刺激下TAK1磷酸化，使用TAK1抑制剂5z-7-ox，并在TRPM7敲除脂肪细胞中检测NF-κB通路和炎症基因。
CaMKII和TRAF6协同调控TAK1激活的机制解析
揭示TRPM7-Ca2+信号激活TAK1的分子桥梁。
检测CaMKII磷酸化，使用KN93和CaMKII过表达/沉默；检测TAK1泛素化，筛选E3 ligase，验证TRAF6、c-Cbl与TAK1的相互作用；双敲低CaMKII和TRAF6检测NF-κB和胰岛素信号。
eWAT局部TAK1过表达对TRPM7敲除表型的逆转
在体内验证TAK1对TRPM7介导脂肪炎症的必要性。
向HFD喂养的Flox和ATKO小鼠eWAT注射AAV-TAK1-Flag或AAV-Vec，16周HFD后检测体重、脂肪重量、CLS、FACS巨噬细胞、炎症基因、NF-κB和胰岛素信号。
FTY720药理学抑制TRPM7的体内效果评估
验证药理学抑制TRPM7是否改善肥胖和胰岛素抵抗。
对肥胖小鼠口服FTY720 8周，检测体重、脂肪重量、空腹血糖和胰岛素、血清TG、GTT、CLS、炎症基因及NF-κB和胰岛素信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养与药物处理 | FTY720 | -- | -- |
| 动物饲养 | D12450J饲料 | Research Diets Inc. | -- |
| D12492饲料 | Research Diets Inc. | -- | |
| 脂肪组织定量 | Inveon多模态PET/CT系统 | Siemens Healthcare | -- |
| 血清指标检测 | ELISA试剂盒 | RayBiotech | -- |
| AAV注射 | AAV8-TAK1载体 | Weizhen biosciences | -- |
| AAV8-Adipoq-Cre载体 | Weizhen biosciences | -- | |
| AAV8对照载体 | Weizhen biosciences | -- | |
| 原代脂肪细胞分离 | 胶原酶D | Sigma-Aldrich | -- |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养与分化 | 罗格列酮 | -- | -- |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 3-异丁基-甲基黄嘌呤 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 流式分析 | FITC抗F4/80抗体 | Biolegend | 123107 |
| PE/Cy5抗CD11b抗体 | Biolegend | 101210 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter Ltd. | -- | |
| 膜片钳记录 | Axopatch 200B膜片钳放大器 | Axon Instrument | -- |
| Sutter P-97水平拉制仪 | Sutter instrument | -- | |
| 钙成像 | Fluo-4 AM钙指示剂 | -- | -- |
| Zeiss LSM880显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| RNA提取与反转录 | RNA纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| QuantiTect反转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Invitrogen | -- |
| LightCycler 480实时PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | PVDF转印膜 | Millipore | -- |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 抗TRPM7抗体 | Sigma-Aldrich | AB15562 | |
| 抗磷酸化IRS-1 (Ser307)抗体 | Cell Signaling Technology | 2381 | |
| 抗IRS-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2382 | |
| 抗磷酸化胰岛素受体β (Tyr1345)抗体 | Cell Signaling Technology | 3026 | |
| 抗胰岛素受体β抗体 | Cell Signaling Technology | 3025 | |
| 抗磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化NFκB-p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗NFκB-p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化IKKβ (Ser180)抗体 | Cell Signaling Technology | 2694 | |
| 抗IKKβ抗体 | Cell Signaling Technology | 8943 | |
| 抗IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9242 | |
| 抗磷酸化TAK1 (Ser412)抗体 | Cell Signaling Technology | 9339 | |
| Western blot/IP | 抗TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5206 |
| Western blot | 抗磷酸化CaMKII (Thr286)抗体 | Cell Signaling Technology | 12716 |
| 抗CaMKII抗体 | Cell Signaling Technology | 50049 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3936 | |
| Western blot/IP | 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 |
| Western blot | 抗HA抗体 | Sigma | H3663 |
| Western blot/IP | 抗TRAF6抗体 | Santa Cruz | sc-8409 |
| Western blot | 抗c-Cbl抗体 | Santa Cruz | sc-1651 |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗α-tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与饮食干预 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、年龄（6-8周龄）、CD（D12450J）或HFD（D12492）喂养16周、ATKO构建（TRPM7fl/fl × Adipoq-Cre）、饲养温度25°C、12 h/12 h光暗周期、湿度40-70% 阅读提示：Methods 'Ethics statement, animal models, and treatments' |
| AAV介导的eWAT基因操作 | AAV8血清型、每侧eWAT 8点注射、每点5 μl（1×10^13 viral genome copies）、HFD喂养12周后注射、注射后4周取材；TAK1过表达实验为AAV注射后继续HFD 16周 阅读提示：Methods 'Ethics statement, animal models, and treatments' 及 Fig. 7 legend |
| FTY720口服给药 | 剂量3 mg/kg/天、给药途径口服、持续时间8周、溶媒对照、n=3 阅读提示：Results 'Pharmacological inhibition of TRPM7 suppresses adipose inflammation and improves glucose tolerance' 及 Fig. 8a legend |
| 原代脂肪细胞与SVF分离及分化 | 胶原酶D 8 mg/ml、Dispase II 2.4 units/ml、消化30 min、220 μm过滤、200 g离心3 min；分化鸡尾酒含5 μg/mL胰岛素、1 μM地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-甲基黄嘌呤、1 μM罗格列酮 阅读提示：Methods 'Primary mature adipocytes isolation' 和 'Stromal vascular fraction isolation, differentiation and FACS analysis' |
| TNF-α刺激与抑制剂处理 | TNF-α常用浓度60 ng/ml（部分qPCR实验40 ng/ml）、刺激时间15 min或12 h、FTY720 5 μM预处理15 min、BAPTA-AM 10 μM预处理30 min、5z-7-ox 100 nM预处理30 min、KN93 10 μM预处理30 min 阅读提示：Fig. 3h、Fig. 4c-e、Fig. 5b-d、Fig. 5f、Fig. 5h 及 Fig. 6 各图注 |
| 葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验 | GTT：过夜禁食16 h、i.p. 1 g/kg葡萄糖、0/30/60/90/120 min测血糖；ITT：禁食6 h、i.p. 0.75 U/kg胰岛素、0/15/30/45/60 min测血糖；急性胰岛素刺激：0.75 U/kg i.p.、20 min后取材 阅读提示：Methods 'Metabolic studies' 及 Fig. 2c-d legend |
| 膜片钳记录TRPM7电流 | 外液含145 mM NaCl、2 mM CaCl2、5 mM KCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES pH 7.3；内液含145 mM Cs-methanesulfonate、8 mM NaCl、10 mM Cs-EGTA、10 mM HEPES pH 7.3；电压斜坡-100至+100 mV、50 ms、间隔2 s；FTY720用于抑制电流 阅读提示：Methods 'Currents recording' 及 Fig. 1c legend |
| 钙成像 | Fluo-4 AM 5 μM、37°C避光负载45 min、激发488 nm/发射530 nm、无二价离子溶液灌流4 min后加入10 mM CaCl2；FTY720 5 μM预处理15 min、TNF-α 60 ng/ml刺激15 min 阅读提示：Methods 'Ca2+ imaging' 及 Fig. 4a-b legend |
| 免疫印迹与免疫共沉淀 | RIPA缓冲液含蛋白酶和磷酸酶抑制剂、SDS-PAGE分离、PVDF膜、抗体稀释比例（如anti-TRPM7 1:500，多数抗体1:1000）、Image J定量磷酸化蛋白并归一化至总蛋白；泛素化实验需加2 mM NEM并加热10 min 阅读提示：Methods 'Western blot analysis, Immunoprecipitation and ubiquitination assay' |