感觉神经支配与切牙间充质稳态
探究感觉神经对切牙间充质组织稳态和MSC维持的作用。
利用AdvillinCreER;Rosa-DTA小鼠他莫昔芬诱导删除感觉神经，通过CT扫描、H&E染色、Dspp原位杂交、切牙生长速率（notch移动）及Gli1-LacZ报告检测MSC数量。
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感觉神经生态位通过FGF/mTOR/自噬轴调控间充质干细胞稳态
Sensory nerve niche regulates mesenchymal stem cell homeostasis via FGF/mTOR/autophagy axis.
实验完整度
高包含体内遗传小鼠模型、体外细胞与离体培养、单细胞/单核测序及机制验证（FGF1-FGFR1-mTOR/自噬）。
主要模型
成年小鼠切牙间充质组织 Gli1-LacZ小鼠及Gli1CreER遗传小鼠模型 三叉神经节感觉神经元 离体切牙外植体培养
重点核对
AdvillinCreER;Rosa-DTA小鼠经他莫昔芬诱导（1.5 mg/10 g体重，腹腔注射）删除感觉神经，评估切牙表型及Gli1+细胞数量 Fgf1 shRNA慢病毒注射至三叉神经节V3区（100 nl，20 nl/min）降低Fgf1表达，验证MSC维持 Gli1CreER;Fgfr1fl/fl小鼠经他莫昔芬诱导删除MSC中Fgfr1，分析切牙生长、组织学及细胞数量 离体切牙外植体培养3天，使用FGF1中和抗体或重组FGF1蛋白（0.5 μg/μl）处理，检测Gli1+细胞 雷帕霉素腹腔注射（8.0 mg/kg/天）处理Gli1CreER;Fgfr1fl/fl小鼠3个月，验证自噬激活对MSC及组织的挽救
摘要
间充质干细胞（MSCs）存在于被称为生态位的微环境中，生态位提供结构支持和分子信号。感觉神经是皮肤、骨髓和造血系统等组织稳态的生态位组分。然而，感觉神经如何影响MSCs的行为在很大程度上仍不清楚。在此，我们展示感觉神经对于间充质组织稳态和持续生长的成年小鼠切牙中MSCs的维持至关重要。感觉神经支配的丧失导致间充质紊乱和MSCs减少。机制上，来自感觉神经的FGF1通过与FGFR1结合直接作用于MSCs，并激活mTOR/自噬轴以维持MSCs。调节mTOR/自噬可恢复MSCs并挽救Fgfr1突变小鼠的间充质组织紊乱。总之，我们的研究为感觉神经在调控MSC稳态中的作用及其调控机制提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 感觉神经是否以及如何调控成年小鼠切牙中间充质干细胞（MSCs）的稳态？
- 核心机制
- 感觉神经分泌的FGF1直接结合MSCs上的FGFR1，激活p-JNK/mTOR/自噬轴，从而维持MSCs的保留、存活和分化。
- 主要证据
- 通过感觉神经删除（AdvillinCreER;Rosa-DTA）、Fgf1敲低、Fgfr1条件性敲除小鼠模型，结合snRNA-seq、scRNA-seq、免疫荧光、Western blot及离体培养，证明FGF1-FGFR1-mTOR/自噬轴调控MSC稳态；雷帕霉素激活自噬可挽救Fgfr1突变小鼠的MSC减少和组织紊乱。
- 研究意义
- 确立了感觉神经作为干细胞生态位通过FGF1-FGFR1-mTOR/自噬轴直接调控MSCs，为组织再生提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
感觉神经与间充质的配体-受体互作鉴定
鉴定感觉神经调控间充质细胞的关键信号通路。
对成年小鼠三叉神经节进行单核RNA测序（snRNA-seq），并与本实验室已发表的切牙scRNA-seq数据整合，用CellChat分析细胞间通讯；通过原位杂交和免疫荧光验证Fgf1/FGF1的表达和来源。
FGF1功能验证：神经来源FGF1对MSC维持的必要性
验证感觉神经来源的FGF1对MSC维持至关重要。
进行下牙槽神经切断术、离体切牙外植体培养（IgG或FGF1中和抗体 beads）、三叉神经节V3区注射Fgf1 shRNA慢病毒，检测MSC数量及切牙表型。
FGF1受体鉴定：FGFR1在MSC中的必要性
确定FGF1直接作用的受体及细胞类型。
利用Gli1CreER;Fgfr1fl/fl小鼠条件性删除MSC中Fgfr1，通过CT、组织学、Dspp表达、生长速率、损伤修复及免疫共沉淀验证FGF1与FGFR1结合；同时用K14rtTA;tetOCre;Fgfr1fl/fl和Gli1CreER;Fgfr2fl/fl小鼠验证特异性。
FGF信号缺失对MSC和TAC动态的影响
解析FGF信号缺失后MSC减少及后续TAC变化的细胞学过程。
在Gli1CreER;Fgfr1fl/fl;Gli1-LacZ小鼠中，于他莫昔芬诱导后不同时间点检测Gli1+细胞数、Ki67+ TAC数、TUNEL凋亡、EdU掺入及Dspp+细胞分化、tdTomato+细胞迁移和钙黄绿素/茜素红双标矿化动态。
FGF信号下游机制：mTOR/自噬通路的激活
探究FGF信号调控MSC稳态的分子机制。
对对照和Gli1CreER;Fgfr1fl/fl小鼠切牙近端间充质进行RNA-seq和IPA分析，通过Western blot检测LC3、p-ULK1、P62、p-mTOR、p-P70S6K、pS6、p-AKT、p-ERK、p-JNK等，免疫荧光验证p-JNK与Gli1+细胞共定位。
自噬激活对MSC和间充质紊乱的挽救
验证激活自噬能否挽救Fgfr1突变小鼠的MSC减少和组织紊乱。
对Gli1CreER;Fgfr1fl/fl小鼠每日腹腔注射雷帕霉素或vehicle，3个月后通过CT、组织学、Dspp表达、Gli1+细胞计数、Ki67+ TAC计数和TUNEL检测评估挽救效果；体外实验检测ROS、LC3 puncta和细胞迁移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 玉米油 | Sigma | C8267 | |
| 多西环素诱导 | 多西环素鼠粮 | ENVIGO | TD.08541 |
| 自噬激活处理 | 雷帕霉素 | LC Laboratories | -- |
| 组织透明化 | 组织透明化试剂 | TCI | T3741 |
| 免疫荧光 | 神经丝抗体 | Abcam | ab4680 |
| Alexa标记二抗 | Invitrogen | -- | |
| EdU掺入实验 | Click-iT Plus EdU细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10637 |
| 免疫荧光 | 封闭液 | PerkinElmer | FP1012 |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | |
| βIIITubulin（TUJ1）抗体 | Abcam | ab18207 | |
| CGRP抗体 | Abcam | ab36001 | |
| 酪氨酸羟化酶（TH）抗体 | Millipore | AB152 | |
| 胆碱乙酰转移酶（ChAT）抗体 | Abcam | ab178850 | |
| FGF1抗体 | Abcam | ab169748 | |
| Advillin（P92）抗体 | Abcam | ab72210 | |
| β-半乳糖苷酶（β-gal）抗体 | Abcam | ab9361 | |
| S100抗体 | Abcam | ab52642 | |
| FGFR1抗体 | Sigma | HPA056402 | |
| p-ERK抗体 | Cell Signaling | 4370 | |
| p-JNK抗体 | Cell Signaling | 9255 | |
| P62抗体 | MBL | PM045 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| LC3抗体 | Abcam | ab48394 | |
| 原位杂交 | RNAscope 2.5 HD RED试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 322350 |
| RNAscope多重荧光v2试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 323100 | |
| Mm-Fgf1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 466661 | |
| Mm-Fgfr1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 454941 | |
| Mm-Fgfr2探针 | Advanced Cell Diagnostics | 443501 | |
| Mm-Fgfr3探针 | Advanced Cell Diagnostics | 440771 | |
| Mm-Fgfr4探针 | Advanced Cell Diagnostics | 443511 | |
| Mm-Dspp探针 | Advanced Cell Diagnostics | 448301 | |
| Mm-Gfra2-C2探针 | Advanced Cell Diagnostics | 441481-C2 | |
| 单核RNA测序 | 单细胞3’文库试剂盒v3.1 | 10x Genomics | PN-1000269 |
| 切牙损伤 | 碳化钨钻 | Brasseler USA | 018554U0 |
| 逆行示踪 | CTB-Alexa488 | Molecular Probes | C-34775 |
| 立体定位注射 | Fgf1 shRNA慢病毒 | Santa Cruz | SC-39445-V |
| 对照shRNA慢病毒 | Santa Cruz | SC-108080 | |
| 离体培养 | FGF1抗体 | R&D system | -- |
| 重组FGF1蛋白 | R&D system | -- | |
| Affi-Gel蓝色琼脂糖珠 | BioRad | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Cell Signaling | 9806 |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 1861278 | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00005 | |
| 抗FGFR1抗体 | Cell Signaling Technology | 9740 | |
| 抗FGF1抗体 | Abcam | ab207321 | |
| 抗LC3抗体 | Abcam | ab48394 | |
| 抗p-ULK1抗体 | Cell Signaling Technology | 14202 | |
| 抗p-mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 5536 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972 | |
| 抗p-p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9204 | |
| 抗p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗p-S6抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 | |
| 抗S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗p-Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗p-p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 抗p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗p-JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9255 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab20272 | |
| 免疫共沉淀 | Protein G Sepharose | GE Healthcare | 10280243 |
| 兔预免疫IgG | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| TUNEL实验 | Click-iT Plus TUNEL试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10617 |
| 细胞培养 | I型胶原酶 | -- | -- |
| α-MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 抗坏血酸 | Sigma | -- | |
| β-甘油磷酸 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| ROS检测 | CellROX Green试剂 | Invitrogen | C10444 |
| 细胞迁移实验 | 结晶紫 | Sigma | -- |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | Tissue-Tek, Sakura | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 感觉神经删除 | AdvillinCreER;Rosa-DTA小鼠他莫昔芬诱导剂量（1.5 mg/10 g体重，腹腔注射）、诱导月龄（1月龄）、分析时间点（诱导后1个月和3个月） 阅读提示：Methods中“Tamoxifen, doxycycline and rapamycin administration”及图1图注 |
| Fgf1敲低 | Fgf1 shRNA慢病毒（Santa Cruz #SC-39445-V）注射体积（100 nl）、注射位点（V3区，AP -2.0 mm, ML ±2.4 mm, DV -6.3 mm）、流速（20 nl/min）、注射后分析时间（4周） 阅读提示：Methods中“Stereotaxic surgeries”及图3图注 |
| Fgfr1条件性敲除 | Gli1CreER;Fgfr1fl/fl小鼠他莫昔芬诱导剂量（1.5 mg/10 g体重，腹腔注射）、诱导月龄（1月龄）、分析时间点（诱导后1周、1个月、3个月） 阅读提示：Methods中“Tamoxifen, doxycycline and rapamycin administration”及图4、图5图注 |
| 离体切牙外植体培养 | 培养基（BGJb + 10% FBS + 1%双抗 + 0.1 mg/ml抗坏血酸）、FGF1抗体或重组FGF1蛋白浓度（0.5 μg/μl）、培养时间（3天） 阅读提示：Methods中“Incisor explant culture”及图3图注 |
| 雷帕霉素挽救实验 | 雷帕霉素剂量（8.0 mg/kg/天，腹腔注射）、溶剂（5% PEG-400/5% Tween-80）、给药持续时间（3个月） 阅读提示：Methods中“Tamoxifen, doxycycline and rapamycin administration”及图7图注 |