Revealing β-TrCP activity dynamics in live cells with a genetically encoded biosensor.
构建荧光/发光生物传感器，结合活细胞成像、生化验证、高通量筛选及多种癌细胞系功能验证。
HeLa细胞系 MCF-10A细胞系 MCF7与MDA-MB-231乳腺癌细胞系 HEK-293T细胞系
β-TrCP1,2 siRNA敲低后报告基因荧光信号升高 过表达β-TrCP1而非ΔF-β-TrCP1突变体降低报告基因信号 MLN-4924（3 μM）处理增加报告基因水平，放线菌酮（100 μg/mL）处理导致报告基因几乎完全丢失 免疫共沉淀验证报告基因与β-TrCP特异性结合，且β-TrCP促进报告基因多聚泛素化 活细胞延时成像监测细胞周期各时相及静息/再进入过程中的β-TrCP活性变化
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建能特异性、灵敏地报告β-TrCP活性的基因编码荧光报告基因。
将人CDC25B不同片段（含非经典降解子DDGFVD，aa268–273，排除APC/C降解子和C端催化结构域）与mVenus融合，部分构建体加NLS，克隆至慢病毒载体EF1α启动子下；根据β-TrCP敲低或MLN-4924处理后荧光变化、动态范围、亚细胞定位及对细胞周期影响评分，筛选出NLS-CDC25B(aa198–338)-mVenus作为β-TrCP报告基因。
验证报告基因的荧光变化是否由β-TrCP活性介导。
在HeLa细胞中使用siRNA敲低β-TrCP1,2、过表达β-TrCP1或ΔF-β-TrCP1，并用MLN-4924、放线菌酮处理，通过活细胞显微成像和定量图像分析测量单细胞报告基因荧光。
验证报告基因是否被β-TrCP特异性结合并多聚泛素化。
在HEK-293T细胞中共转染报告基因或突变报告基因（DDGFVD突变为AAGFVA）与β-TrCP、ΔF-β-TrCP、His-泛素，进行免疫共沉淀和Ni-NTA pull-down，免疫印迹检测mVenus和泛素；在稳定表达报告基因的HeLa细胞中敲低β-TrCP1,2或Cullin1后检测多聚泛素化。
研究β-TrCP活性在细胞周期进程及静息-再进入过程中的动态变化。
对表达β-TrCP报告基因和H2B-mTurquoise的HeLa细胞进行延时成像，比较APC/C和SCFSkp2报告基因；在MCF-10A细胞中进行有丝分裂原撤除和刺激实验；使用MLN-4924和放线菌酮处理确定合成和降解速率。
探究β-TrCP蛋白水平是否决定其活性。
对表达β-TrCP报告基因的MCF-10A、MCF7、MDA-MB-231细胞先进行活细胞成像测量活性，固定后免疫荧光染色β-TrCP，分析单细胞活性与蛋白水平相关性；并在多种细胞系中比较蛋白水平与活性。
验证β-TrCP活性调控是否发生在SCF复合物组装水平。
在静息与有丝分裂原刺激的MCF-10A细胞以及MCF7和MDA-MB-231细胞中，用抗β-TrCP抗体免疫共沉淀，免疫印迹检测Skp1和Cullin1，评估β-TrCP与SCF核心组分的相对结合量。
评估不同癌细胞对β-TrCP活性的依赖及其功能后果。
在MCF7和MDA-MB-231细胞中敲低β-TrCP1,2，进行克隆形成实验、Annexin V/PI流式凋亡检测、NF-κB靶基因免疫印迹，以及多柔比星剂量反应CCK-8实验。
利用报告基因筛选调节β-TrCP活性小分子并鉴定关键信号通路。
构建NanoLuc发光报告基因稳定表达MDA-MB-231细胞，在1536孔板中筛选MIPE 5.0和NPC 2.0库约5000种化合物，以MLN-4924和放线菌酮为对照，检测发光强度；对候选化合物进行剂量反应验证，并验证舒尼替尼对β-TrCP与Skp1结合及化疗敏感性的影响。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco, Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 无酚红DMEM/F12培养基 | Invitrogen | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | MLN-4924 | Calbiochem | -- |
| MG132 | Calbiochem | -- | |
| 苹果酸舒尼替尼 | -- | -- | |
| siRNA转染 | Dharmafect 1转染试剂 | Horizon Discovery, Ltd | -- |
| On-Target plus对照siRNA | Dharmacon | -- | |
| β-TrCP1 siRNA | Dharmacon | L-003463-00-0005 | |
| β-TrCP2 siRNA | Dharmacon | L-003490-00-0005 | |
| FBXW7 siRNA | Dharmacon | L-004264-00-0005 | |
| 细胞增殖实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| 微孔板读数仪 | Tecan | -- | |
| 凋亡分析 | Annexin V FITC/PI死细胞凋亡检测试剂盒 | Thermo Fisher | V13242 |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 高通量筛选 | NanoGlo荧光素酶检测试剂 | Promega | -- |
| PHERAstar FSX微孔板读数仪 | BMG Labtech | -- | |
| 1536孔实底组织培养板 | Greiner | -- | |
| BioRaptr 2 FRD分液器 | Let’s Go Robotics | -- | |
| RT-qPCR | RLT RNeasy 96 Qiacube HT试剂盒 | Qiagen | 74171 |
| 柱上DNA消化试剂 | Qiagen | 79254 | |
| 免疫荧光 | 抗β-TrCP抗体 | -- | sc366369 |
| Alexa Fluor-647标记二抗 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | BCA蛋白定量试剂 | Thermo Scientific | 23225 |
| Tris-Glycine电泳缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| turbo转膜缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| HRP标记抗兔IgG二抗 | CST | 7074 | |
| HRP标记抗小鼠IgG二抗 | CST | 7076 | |
| HRP标记小鼠抗山羊IgG二抗 | SCBT | sc2354 | |
| SuperSignal West Pico和Femto PLUS化学发光试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 抗mVenus抗体 | MyBioSource | MBS448126 | |
| 抗β-TrCP抗体 | Abcam | ab71753 | |
| 免疫共沉淀 | 抗β-TrCP抗体 | SCBT | sc390629 |
| 免疫荧光 | 抗β-TrCP抗体 | CST | 4394 |
| 免疫印迹 | 抗β-连环蛋白抗体 | BD | 610153 |
| 抗Vinculin抗体 | Sigma | V9131 | |
| 抗FBXW7抗体 | Abcam | ab109617 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗泛素抗体 | SCBT | sc8017 | |
| 抗Cullin1抗体 | SCBT | sc17775 | |
| 抗SKP1抗体 | SCBT | sc5281 | |
| 抗CDC25B抗体 | CST | 9525 | |
| 抗Emi1抗体 | SCBT | sc365212 | |
| 抗HSP90抗体 | CST | 4877 | |
| 抗Bcl-XL抗体 | CST | 2764 | |
| 抗Bcl2抗体 | CST | 3498 | |
| 抗p65抗体 | CST | 8242 | |
| 抗IκBα抗体 | CST | 4812 | |
| 抗caspase 3抗体 | CST | 14220 | |
| 抗Cullin1抗体 | CST | 4995 | |
| 抗cleaved PARP抗体 | CST | 5625 | |
| 抗NEDD8抗体 | CST | 2745 | |
| 抗FBXO31抗体 | Bethyl | A302-047A | |
| 免疫共沉淀 | 抗小鼠IgG抗体 | SCBT | sc2025 |
| 免疫印迹 | 抗DYRK1A抗体 | SCBT | sc100376 |
| 抗PFKFB3抗体 | MyBioSource | MBS9604769 | |
| 抗FBXW5抗体 | MyBioSource | MBS9611762 | |
| 抗FBXO25抗体 | MyBioSource | MBS3017705 | |
| 抗FBXW11抗体 | Thermo scientific | PA5-109715 | |
| 抗cMyc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab6276 | |
| 泛素化实验 | Ni-NTA珠 | -- | -- |
| 活细胞成像 | 96孔板 | Ibidi | 89626 |
| 胶原蛋白 | -- | -- | |
| Nikon Ti2-E倒置显微镜 | Nikon | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 报告基因构建与验证 | 报告基因片段：CDC25B aa198–338，NLS序列，mVenus标签；突变报告基因DDGFVD突变为AAGFVA；启动子为EF1α；慢病毒载体CSII-pEF1a 阅读提示：Methods中Constructs and stable cell lines；Fig. 1c；Supplementary Fig. 1a–c |
| 活细胞延时成像 | 细胞接种密度、成像间隔12分钟、物镜10×/20×、曝光时间<150 ms、37°C 5% CO2；HeLa和MCF-10A细胞；H2B-mTurquoise标记细胞核 阅读提示：Methods中Time-lapse microscopy；Fig. 3a–c；Supplementary Fig. 3a–c |
| 抑制剂处理 | MLN-4924 3 μM、放线菌酮100 μg/mL、MG132 5 μM、舒尼替尼5 μM的处理时间（如图注6小时或4小时），溶剂DMSO对照 阅读提示：Methods中Inhibitors；Fig. 1f,g；Fig. 2b–f；Fig. 5g–i |
| siRNA敲低 | β-TrCP1,2、FBXW7、Cullin1 siRNA终浓度20 nM（凋亡实验用2 nM），转染试剂Dharmafect 1，转染后18小时开始成像 阅读提示：Methods中siRNA transfection/shRNA；Fig. 1d,e；Fig. 3d；Supplementary Fig. 3d–g |
| 高通量筛选 | MDA-MB-231细胞密度2.75×10^5 cells/mL，1536孔板，化合物终浓度13 μM初筛，DMSO终浓度0.46%，处理6小时，NanoGlo检测发光 阅读提示：Methods中High-throughput SCF-β-TrCP-NLuc reporter assay；Fig. 5b–d |
| 免疫共沉淀检测β-TrCP与SCF结合 | 抗β-TrCP抗体用量2 μg，细胞裂解液成分，蛋白上样量400–800 μg，孵育12–16小时，protein G-agarose beads孵育2小时 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation；Fig. 3l；Fig. 4e；Fig. 5i |
