YQDZ成分鉴定
鉴定YQDZ中的主要生物活性成分
采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对YQDZ冻干粉进行正负离子模式扫描，鉴定化学成分。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
益气导滞方通过靶向TLR4/NF-κB/MAPK信号通路改善术后肠梗阻的机制研究
Mechanism Study of Yi-Qi-Dao-Zhi Formula in Improving Postoperative Ileus by Targeting the TLR4/NF-κB/MAPK Signaling Pathways.
实验完整度
高包含体内小鼠模型（POI模型、炭墨推进、HE、免疫荧光、免疫组化、Western blot、RT-qPCR、ELISA）和体外细胞实验（LPS诱导RAW264.7、CCK-8、流式、转录组、Western blot），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
POI小鼠模型（C57小鼠，手术诱导） RAW264.7小鼠巨噬细胞系（LPS诱导M1型炎症模型）
重点核对
YQDZ剂量：体内低剂量7.965 g/kg、高剂量15.93 g/kg，体外浓度200 μg/mL LPS刺激浓度和时长：1 μg/mL，体内模型1小时，体外6小时 POI模型建立：腹部切口，小肠操作，盐水洗涤三周期 检测指标：肠道推进率、炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）水平、巨噬细胞标志物（F4/80, CD86）表达 信号通路：TLR4/NF-κB/MAPK相关蛋白（p-p65, p-p38, p-ERK, p-JNK）的磷酸化水平
摘要
目的：术后肠梗阻（POI）常妨碍手术后的恢复。虽然益气导滞方（YQDZ）在临床治疗早发性卵巢功能不全方面已证明其价值，但其确切的作用机制仍未被充分了解。方法：本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）来确定YQDZ中的关键生物活性化合物。对于体内实验，通过手术干预建立POI小鼠模型，并通过炭墨实验评估胃肠传输功能。使用HE染色检查肠道组织病理学。通过一系列先进的实验技术，包括免疫荧光染色、免疫组织化学分析、Western blot、实时定量PCR和ELISA检测，全面评估YQDZ对POI的治疗效果。体外实验通过LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞建立M1型炎症模型。其他评估包括CCK-8检测、流式细胞术、转录组分析、实时PCR和蛋白质水平检测，旨在探究YQDZ的作用方式。结果：YQDZ通过TLR4/NF-κB/MAPK信号通路引导M1巨噬细胞分化。该作用有效降低了包括TNF-α、IL-1β和IL-6在内的关键炎症介质的水平。因此，它作为术后肠梗阻小鼠肠道炎症的治疗剂，帮助恢复其胃肠功能。结论：YQDZ治疗POI的方法可能与调节TLR4/NF-κB/MAPK信号通路以及抑制巨噬细胞极化有关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YQDZ是否通过调节TLR4/NF-κB/MAPK信号通路和巨噬细胞极化来改善术后肠梗阻？
- 核心机制
- YQDZ通过抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路的激活，从而抑制M1巨噬细胞极化，减少促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的产生，减轻肠道炎症并恢复胃肠运动功能。
- 主要证据
- 在POI小鼠模型中，YQDZ显著提高肠道推进率，减轻肠道组织病理损伤，降低炎症因子表达，并抑制巨噬细胞浸润；在LPS诱导的RAW264.7细胞中，YQDZ抑制M1极化标志物CD86和iNOS表达，降低炎症因子分泌，并抑制TLR4/NF-κB/MAPK通路蛋白磷酸化。
- 研究意义
- 研究为YQDZ在术后胃肠功能障碍中的临床应用提供了机制依据，并突显了中药复方多靶点治疗的特点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
POI小鼠模型建立与药效评估
建立POI小鼠模型，评估YQDZ对肠道运动功能和炎症的影响
通过手术建立POI小鼠模型，分为Sham、POI、YQDZ低剂量、YQDZ高剂量和莫沙必利组。术后给药，通过炭墨推进实验评估肠道运动，HE染色观察组织病理，RT-qPCR和ELISA检测炎症因子。
巨噬细胞浸润检测
评估YQDZ对POI小鼠肠道巨噬细胞浸润的影响
通过免疫荧光染色检测肠道组织中F4/80阳性巨噬细胞。
体外RAW264.7细胞M1极化模型
研究YQDZ对LPS诱导的RAW264.7细胞M1极化和炎症的影响
用LPS诱导RAW264.7细胞M1型极化，给予YQDZ处理，检测细胞活力、CD86表达、炎症因子分泌和mRNA表达。
转录组分析
探究YQDZ对LPS诱导的巨噬细胞基因表达谱的影响
对Control、LPS和YQDZ处理组细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因、KEGG通路富集和GSEA。
通路蛋白验证
验证YQDZ对TLR4/NF-κB/MAPK通路蛋白表达的影响
通过Western blot和免疫组化检测体内外样本中TLR4、p-p65、p-p38、p-ERK、p-JNK及iNOS的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | #4370 |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | #4695 | |
| p-p38抗体 | Cell Signaling Technology | #4511 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | #8690 | |
| p-p65抗体 | Cell Signaling Technology | #3033 | |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | #8242 | |
| p-JNK抗体 | Abmart | T40074 | |
| iNOS抗体 | Abmart | T55993 | |
| TLR4抗体 | Proteintech Group, Inc. | 66,350-1-Ig | |
| JNK抗体 | Proteintech Group, Inc. | 24164-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc. | 60004-1-Ig | |
| 小鼠二抗 | Proteintech Group, Inc. | RGAM001 | |
| 兔二抗 | Proteintech Group, Inc. | RGAR001 | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Epizyme Biomedical Technology Co.,Ltd. | -- |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Epizyme Biomedical Technology Co.,Ltd. | -- | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | -- | |
| Flow cytometry | FITC-CD86抗体 | BD Biosciences | -- |
| 成分鉴定 | Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Kinetex C18色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| Q Exactive HFX质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | RAW 264.7细胞系 | Stem Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | -- |
| 药物处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| 益气导滞方提取物 | Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine | -- | |
| 动物实验 | 莫沙必利 | -- | -- |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| POI模型建立 | 小鼠品系（C57）、性别（雄性）、年龄（6-8周）、体重（20-22g）、禁食时间（24小时）、手术步骤（腹部切口、小肠操作、盐水洗涤三次各4分钟） 阅读提示：Methods: Animals and Models |
| 给药方案 | YQDZ剂量（低7.965 g/kg，高15.93 g/kg）、给药方式（灌胃）、给药频率（每12小时）、给药起始时间（术后1小时） 阅读提示：Methods: Animals and Models |
| 肠道运动功能评估 | 炭墨浓度（5%）、活性炭与阿拉伯胶比例（0.5g:0.25g在10mL生理盐水中）、给药体积（0.1mL/10g）、检测时间（术后48小时，灌胃后15分钟） 阅读提示：Methods: Evaluation of the Intestinal Motility |
| 体外细胞实验 | RAW264.7细胞培养条件（10% FBS, 1%青霉素-链霉素，37°C, 5% CO2）、LPS浓度（1 μg/mL）和刺激时间（6小时，用于YQDZ治疗组）、YQDZ浓度（200 μg/mL）、处理时间（18小时） 阅读提示：Methods: Cell Culture and Cell Viability Assay, Cell Grouping |
| 流式细胞术检测M1极化 | 固定液（4%多聚甲醛）、透化液（0.3% Triton X-100）、封闭液（1% BSA）、CD86抗体用量（0.25 μg）、孵育温度和时间（40°C, 30分钟） 阅读提示：Methods: Flow Cytometry Analysis |