EAP小鼠模型诱导与验证
建立EAP小鼠模型，并评估模型是否成功模拟CP/CPPS的盆腔疼痛和前列腺炎症。
使用NOD-shiltjnju小鼠，以PAgs与CFA乳化后皮下免疫（第0天和28天），第42天处死。通过von Frey纤维丝检测机械性触觉痛觉过敏，并通过HE染色评估前列腺炎症程度。
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通过调控Th17细胞趋化性在实验性自身免疫性前列腺炎中揭示CCL20的作用
Unraveling CCL20's role by regulating Th17 cell chemotaxis in experimental autoimmune prostatitis.
实验完整度
高包含EAP小鼠模型、细胞实验、体外趋化实验、免疫荧光共定位及信号通路磷酸化检测等多层级验证，且涉及功能中和抗体与重组细胞因子干预。
主要模型
EAP小鼠模型（NOD-shiltjnju小鼠） 原代Th17细胞 BMDM（骨髓来源巨噬细胞） RAW264.7巨噬细胞系
重点核对
EAP模型诱导：PAgs 300 mg/只与CFA等体积乳化，皮下注射，第0天和第28天免疫，第42天处死。 中和抗体处理：抗CCL20抗体20μg/只、抗IL-17A抗体10μg/只，腹腔注射，于诱导前1天及第6、13、20、27、34、41天。 重组细胞因子处理：rCCL20 200μg/只、rIL-17A 100μg/只，腹腔注射，在初次和二次免疫后连续7天。 体外趋化实验：Transwell小室，8μm孔径，上室1×10^4 Th17细胞，下室rCCL20 10ng/mL或抗CCL20抗体10ng/mL，孵育12小时。 巨噬细胞处理：BMDM和RAW264.7先用IL-17A 100ng/mL处理12h，再用LPS 100ng/mL处理12h。
摘要
慢性前列腺炎和慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）是一种普遍存在的泌尿系统疾病，对男性的健康产生深远影响。由Th17细胞驱动的自身免疫已被推测为CP/CPPS发病的潜在因素。然而，阐明调控Th17细胞募集到前列腺并触发炎症的精确机制仍是一个紧迫的问题。本研究揭示，CCL20在吸引Th17细胞到前列腺中发挥关键作用，从而促进前列腺炎的发展。此外，它确定了前列腺基质细胞和免疫细胞可能是CCL20的来源。另外，这项研究发现，由Th17细胞释放的IL-17A可以通过NF-κB/MAPK/PI3K通路刺激巨噬细胞产生CCL20。IL-17A和CCL20之间的相互作用建立了一个正反馈回路，这可能是慢性前列腺炎发展的关键机制，从而增加了其治疗难度。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCL20是否通过调控Th17细胞趋化性参与实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）的发生发展，以及其来源和产生机制是什么？
- 核心机制
- 前列腺内CCL20通过CCR6受体趋化Th17细胞浸润；Th17细胞分泌的IL-17A通过NF-κB/MAPK/PI3K通路刺激巨噬细胞产生更多CCL20，形成正反馈环，加剧炎症。
- 主要证据
- 在EAP小鼠模型中，前列腺中CCL20和Th17细胞浸润增加；体外Transwell实验证实CCL20促进Th17细胞迁移；免疫荧光显示CCL20与CD4+ T细胞、巨噬细胞和基质细胞共定位；体外巨噬细胞实验和体内中和抗体实验支持IL-17A通过NF-κB/MAPK/PI3K通路促进CCL20分泌。
- 研究意义
- 研究揭示了CCL20作为前列腺炎发病中关键介质的作用，可能作为前列腺炎治疗的潜在靶点和新的诊断标志物，但需大量临床研究验证其临床效用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Th17细胞在脾脏和前列腺中的检测
验证EAP小鼠中Th17细胞的过度活化及前列腺浸润情况。
使用流式细胞术检测脾脏和前列腺中CD4+IL-17A+细胞比例，ELISA检测血清和前列腺中IL-17A等炎性细胞因子水平，RT-qPCR和Western blot检测前列腺中IL-17A表达。
CCL20在EAP小鼠前列腺中的表达分析
探究CCL20及其受体CCR6在EAP小鼠前列腺中的表达是否升高，以支持其可能参与Th17细胞募集。
通过免疫组化检测CCL20阳性细胞，RT-qPCR检测CCL20和CCR6 mRNA水平，Western blot检测蛋白表达，ELISA检测血清和前列腺中CCL20水平。
CCL20对Th17细胞趋化性的体外和体内验证
验证CCL20是否能直接趋化Th17细胞，以及中和CCL20或补充重组CCL20对EAP小鼠Th17细胞浸润和炎症的影响。
体外：Transwell实验检测rCCL20和抗CCL20抗体对原代Th17细胞迁移的影响，并用CCK-8检测细胞活力。体内：腹腔注射rCCL20、抗CCL20抗体，评估前列腺中IL-17A表达和CD4+IL-17A+细胞比例。
CCL20细胞来源鉴定
确定前列腺中产生CCL20的细胞类型。
通过双色免疫荧光共定位实验，标记CCL20与细胞表型标志物（CD4、CD116、α-SMA、Vimentin），观察共定位情况并定量荧光强度。
IL-17A调节巨噬细胞CCL20分泌的机制研究
探究IL-17A是否通过特定信号通路刺激巨噬细胞产生CCL20。
用IL-17A和/或LPS处理BMDM和RAW264.7细胞，检测CCL20表达及相关信号通路蛋白的磷酸化水平（mTOR、AKT、p65、ERK1/2、P38），并通过体内实验验证IL-17A对前列腺CCL20表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
建立疾病模型
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAP诱导 | 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5881 |
| 抗小鼠CCL20中和抗体 | R&D system | AF760 | |
| 抗小鼠IL-17A中和抗体 | R&D system | MAB421 | |
| 重组小鼠CCL20 | Peprotech | 250-27 | |
| 重组小鼠IL-17A | Peprotech | 210-17 | |
| 组织病理学检查 | 数字切片扫描仪 | KFBIO | KF-PRO-005-EX |
| 免疫组织化学 | 柠檬酸缓冲液 | Servicebio | G1202 |
| SABC-HRP试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0615 | |
| 抗CCL20抗体 | Affinity | DF2238 | |
| 抗IL-17A抗体 | Affinity | DF6127 | |
| 免疫荧光 | 抗CD4抗体 | Elabscience | E-AB-22098 |
| 抗CD116抗体 | Affinity | DF4820 | |
| 抗α-SMA抗体 | Affinity | BF9212 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Affinity | BF8006 | |
| Cy3标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB22301 | |
| DAPI | Servicebio | G1012 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV3000 | |
| ELISA | IL-17A ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0047c |
| IL-17F ELISA试剂盒 | Multi-Science | EK2196 | |
| IL-22 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M2446 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0048 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | |
| GM-CSF ELISA试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0022 | |
| CCL20 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0013 | |
| RNA提取和RT-qPCR | RNA纯化试剂盒Plus | Esscience | RN002plus |
| 分光光度计 | NanoDrop | 2000 | |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT试剂盒 | Takara | RR047A |
| TB Green® Premix Ex | Takara | RR820A | |
| ABI7500平台 | Thermo | -- | |
| 引物合成 | 引物 | Sangon Biotech | -- |
| 流式细胞术 | RPMI-1640培养基 | BasalMedia | L210KJ |
| 胎牛血清 | WISENT Corporation | 086-150 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | #10104159001 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | #15630106 | |
| 胶原酶D | Roche | #11088858001 | |
| APC-抗CD3e | BD Bioscience | 553066 | |
| FITC-抗CD4 | BD Bioscience | 553047 | |
| PE-抗IL-17A | BD Bioscience | 559502 | |
| PerCP-Cy-抗F4/80 | BD Bioscience | 746070 | |
| 佛波醇酯 | Multi-Science | CS0001 | |
| 离子霉素 | Multi-Science | CS0002 | |
| 莫能菌素 | Multi-Science | CS0004 | |
| 固定/破膜缓冲液 | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Elabscience | E-BC-R327 |
| 上样缓冲液 | wshtbio | ES003 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Epizyme | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Elabscience | E-AB-40337 | |
| 抗CCR6抗体 | SinoBiogical | #106771-T32 | |
| 抗P65抗体 | Affinity | AF5006 | |
| 抗磷酸化P65抗体 | Affinity | AF2006 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Affinity | AF0155 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Affinity | AF1015 | |
| 抗P38抗体 | Affinity | AF6456 | |
| 抗磷酸化P38抗体 | Affinity | AF4001 | |
| 抗mTOR抗体 | CST | 2983T | |
| 抗磷酸化mTOR抗体 | CST | 5536T | |
| 抗AKT抗体 | CST | 4691T | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | CST | 4060T | |
| 二抗 | Elabscience | E-AB-1003 | |
| ECL化学发光系统 | ClinX | -- | |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- |
| 高糖DMEM培养基 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Solarbio | L8880 |
| 原代细胞分离和分化 | 重组小鼠IL-6 | Novoprotein | CG39 |
| 重组小鼠IL-23 | Novoprotein | CS31 | |
| 重组人TGF-β | Novoprotein | CA59 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Bio X Cell | BE0055 | |
| 抗IL-4抗体 | Bio X Cell | BE0045 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | CB34 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Servicebio | G4103 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAP诱导 | 小鼠品系：NOD-shiltjnju；免疫剂量：PAgs 300mg/只；CFA乳化；注射途径：皮下（足垫和尾根部）；体积：200μL/只；免疫时间：第0天和28天；处死时间：第42天；每组最少4只。 阅读提示：见Materials and Methods 2.1节 |
| 疼痛行为学评估 | von Frey filament压力等级；刺激次数；阳性反应标准。 阅读提示：见Materials and Methods 2.2节及Figure 1A-C |
| 组织病理学 | 组织固定、包埋、切片厚度（5μm）、染色方法、炎症评分标准。 阅读提示：见Materials and Methods 2.3节 |
| 免疫组化 | 抗原修复条件（柠檬酸缓冲液pH6.0）、抗体稀释度（anti-CCL20 1:200；anti-IL-17A 1:200）、检测试剂盒。 阅读提示：见Materials and Methods 2.4节 |
| 免疫荧光 | 抗体稀释度（anti-CCL20 1:200；anti-CD4 1:500；anti-CD116 1:500；anti-α-SMA 1:500；anti-vimatin 1:500）、二抗稀释度、DAPI染色。 阅读提示：见Materials and Methods 2.5节 |
| ELISA | 检测细胞因子种类（IL-17A, IL-17F, IL-22, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, CCL20）、血清和前列腺组织样本处理。 阅读提示：见Materials and Methods 2.6节 |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR试剂盒、引物序列（表S1）、反应体积（20μL）、内参基因、数据分析方法（2^-ΔΔCt）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.7节及Table S1 |
| 流式细胞术 | 组织消化液配方（RPMI-1640, FBS 10%, DNase I 0.01%, HEPES 10mM, collagenase D 1mg/mL）、刺激条件（PMA 50ng/mL, ionomycin 1000ng/mL, monensin 25μg/mL, 4小时）、胞内染色步骤。 阅读提示：见Materials and Methods 2.8节 |
| Western blot | 裂解液（RIPA）、凝胶浓度（12.5%）、膜类型（0.22μm硝酸纤维素膜）、封闭液（5% BSA）、一抗稀释度、二抗稀释度、ECL检测。 阅读提示：见Materials and Methods 2.9节 |
| 细胞培养和处理 | 细胞系/原代细胞培养条件（培养基、血清、抗生素）、IL-17A浓度（100ng/mL）和处理时间（12h）、LPS浓度（100ng/mL）和处理时间（12h）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.10节及2.11节 |
| Th17细胞分化 | naive CD4+ T细胞分离纯度、分化因子浓度（IL-6 40ng/mL, IL-23 40ng/mL, TGF-β 1ng/mL, anti-IFN-γ 20μg/mL, anti-IL-4 20μg/mL）、培养时间（4天）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.11节及Figure S1 |
| BMDM分化 | M-CSF浓度（50ng/mL）、分化时间（7天）、培养基更换频率（每3天）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.11节及Figure S1 |
| 细胞活力检测 | 细胞数量（5×10^3）、培养时间（12h）、CCK-8检测时间（2h）、波长（450nm）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.12节 |
| Transwell趋化实验 | 孔径（8μm）、上室细胞数（1×10^4）、下室条件（10% FBS DMEM, rCCL20 10ng/mL或抗CCL20抗体10ng/mL）、孵育时间（12h）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.13节 |
| 统计 | 独立重复次数（≥3）、数据表示（mean±SD）、统计方法（t检验或one-way ANOVA, Bonferroni事后检验）、显著性水平（p<0.05）。 阅读提示：见Materials and Methods 2.14节 |