鉴定NCAPG的下游转录因子
通过整合ATAC-Seq和RNA-Seq数据，确定NCAPG敲低后染色质可及性改变的转录因子。
对HEC-1-A细胞进行NCAPG敲低（KD-NCAPG）和对照（KD-NC），进行ATAC-Seq（每个样本两个生物学重复）和既往RNA-Seq分析。使用HOMER进行基序注释，TRRUST预测上游转录因子，KEGG富集分析。
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NCAPG 通过 LEF1/SEMA7A/PI3K-AKT 促进子宫内膜样癌的恶性进展
NCAPG promotes the malignant progression of endometrioid cancer through LEF1/SEMA7A/PI3K-AKT.
实验完整度
高包含细胞实验（增殖、迁移、侵袭、细胞周期）、机制验证（ATAC-Seq、ChIP、CoIP、荧光素酶）、体内异种移植模型及临床样本相关性分析。
主要模型
HEC-1-A细胞系 HEC-1-B细胞系 Ishikawa细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
NCAPG敲低和过表达的稳定细胞系构建（慢病毒转染，嘌呤霉素筛选） ATAC-Seq和RNA-Seq的整合分析条件 LEF1与SEMA7A启动子结合的ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因验证 SEMA7A与PI3K p85亚基的CoIP和免疫荧光共定位 裸鼠异种移植瘤实验中NCAPG敲低和LEF1过表达对肿瘤生长的影响
摘要
NCAPG 通过 PI3K-AKT 通路促进子宫内膜癌（EC）的进展，并具有作为新型肿瘤标志物的潜力。然而，NCAPG 的精确调控机制仍未完全阐明。在本研究中，我们首次应用转座酶可及染色质高通量测序（ATAC-Seq）分析，结合染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP）和免疫共沉淀（CoIP）分析，发现 NCAPG 通过影响 LEF1 与染色质的结合，进而影响下游 SEMA7A 的转录，从而促进 EC 细胞的增殖、迁移和侵袭。机制上，SEMA7A 通过与 PI3K 调节亚基 p85 结合来调节 PI3K-AKT 信号通路，发挥其生物学功能。NCAPG/LEF1/SEMA7A 轴通过激活 PI3K-AKT 信号通路促进 EC 的肿瘤发生和进展。此外，LEF1 和 SEMA7A 与 EC 患者的 FIGO 分期、病理分级和肌层浸润相关。NCAPG、LEF1 和 SEMA7A 的表达高度一致。靶向这一级联反应可能为延缓 EC 进展提供有效的抗肿瘤策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NCAPG通过何种中间机制调控PI3K-AKT通路并促进子宫内膜癌进展？
- 核心机制
- NCAPG通过改变转录因子LEF1的染色质可及性，增强LEF1与SEMA7A启动子的结合，促进SEMA7A转录；SEMA7A膜蛋白与PI3K调节亚基p85结合，激活PI3K-AKT信号通路。
- 主要证据
- ATAC-Seq和RNA-Seq联合分析鉴定LEF1为关键转录因子；ChIP-qPCR和荧光素酶实验证实LEF1直接结合并激活SEMA7A启动子；CoIP和免疫荧光显示SEMA7A与p85共定位和相互作用；细胞和体内实验证明NCAPG/LEF1/SEMA7A轴促进增殖、迁移、侵袭及肿瘤生长。
- 研究意义
- 靶向NCAPG/LEF1/SEMA7A/PI3K-AKT级联反应可能为延缓子宫内膜癌进展提供有效的抗肿瘤策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LEF1功能
验证LEF1在NCAPG调控的细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期中的作用。
在NCAPG敲低细胞中过表达LEF1（OE-LEF1），检测LEF1 mRNA和蛋白水平（核和质），并用CCK8、Transwell和流式细胞术检测细胞功能。
确认SEMA7A为LEF1的下游靶基因
验证LEF1是否直接结合SEMA7A启动子并激活其转录。
利用JASPAR预测结合位点，ChIP-qPCR检测LEF1与SEMA7A启动子结合；构建野生型和突变型SEMA7A启动子荧光素酶报告载体，在293T细胞中进行双荧光素酶实验。此外，在NCAPG敲低细胞中过表达LEF1观察SEMA7A表达变化，以及NCAPG过表达细胞中敲低SEMA7A观察功能逆转。
验证SEMA7A与p85结合并激活PI3K-AKT通路
验证SEMA7A与PI3K调节亚基p85的相互作用及其对PI3K-AKT通路的激活。
在HEC-1-A细胞中过表达SEMA7A，进行CoIP验证SEMA7A与p85结合；免疫荧光检测共定位；Western blot检测SEMA7A敲低或过表达后p-PI3K、p-AKT等表达变化。
体内肿瘤模型验证
验证LEF1过表达能否逆转NCAPG敲低引起的体内肿瘤生长抑制。
将HEC-1-A细胞（KD-NC、KD-NCAPG、KD-NCAPG+OE-LEF1）皮下注射到裸鼠，21天后处死，测量肿瘤体积和重量，IHC检测NCAPG、Ki-67、LEF1、SEMA7A、p-PI3K和p-AKT表达。
临床样本相关性分析
分析LEF1和SEMA7A表达与EC患者临床病理特征的相关性及与NCAPG表达的一致性。
对84例子宫内膜样癌患者组织进行IHC染色，评估LEF1、SEMA7A表达水平，使用卡方检验和McNemar检验分析相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| IHC染色 | 抗NCAPG抗体 | Proteintech | 24563-1-AP |
| 抗LEF1抗体 | HUABIO | HA500273 | |
| 抗SEMA7A抗体 | HUABIO | ER1905-75 | |
| 全景扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| HiScript II Q逆转录预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| 罗氏Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| Western blotting | 细胞蛋白提取试剂盒 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| 抗NCAPG抗体 | Abcam | ab226805 | |
| 抗LEF1抗体 | Proteintech | 14927-1-AP | |
| 抗SEMA7A抗体 | Proteintech | 18070-1-AP | |
| 抗CDK6抗体 | Proteintech | 14052-1-AP | |
| 抗Cyclin E1抗体 | Proteintech | 11554-1-AP | |
| 抗Cyclin D1抗体 | Proteintech | 26939-1-AP | |
| 抗磷酸化PI3激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 4228T | |
| 抗PI3激酶抗体 | Proteintech | 67071-1-Ig | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| 抗AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 抗PCNA抗体 | Proteintech | 10205-2-AP | |
| 抗ATP1A1抗体 | Proteintech | 14418-1-AP | |
| ChemiScope6100化学发光检测系统 | -- | -- | |
| IP实验 | 裂解缓冲液 | abiowell | AWB0144 |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- | |
| 细胞增殖实验 | CCK8检测试剂盒 | Abmole Bioscience | -- |
| ATAC-seq | ATAC-Seq文库制备试剂盒 | ApexBio | -- |
| 细胞周期分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | BECKMAN COULTER | A00-1-1102 |
| ChIP实验 | Pierce琼脂糖ChIP试剂盒 | Abcam | ab500 |
| 荧光素酶实验 | pGL3-Basic荧光素酶报告载体 | HonorGene | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 免疫荧光 | 荧光显微镜 | Motic | BA210T |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Weitong Lihua Limited Company | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源（Procell），NCAPG敲低和过表达慢病毒（Genechem），LEF1/SEMA7A shRNA（HonorGene），转染试剂（Lipofectamine 2000），筛选浓度（嘌呤霉素2.5 µg/µl，7天） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Cell culture and transfection' |
| ATAC-seq与RNA-seq分析 | NCAPG敲低细胞（KD-NCAPG）和对照（KD-NC），每组两个生物学重复，参考基因组hg38，HOMER基序分析，KEGG富集分析 阅读提示：参见Materials and Methods中的'ATAC-seq and RNA-seq'及Figure 1 |
| ChIP-qPCR与荧光素酶实验 | LEF1结合SEMA7A启动子位点，ChIP试剂盒（ab500；Abcam），IgG阴性对照，引物序列，293T细胞双荧光素酶实验，突变型启动子 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Chromatin immunoprecipitation-qPCR'和'Luciferase assay'，以及Figure 3 |
| SEMA7A与p85相互作用验证 | CoIP使用SEMA7A抗体和p85抗体，免疫荧光共定位，SEMA7A敲低或过表达后Western blot检测p-PI3K/p-AKT 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Western blotting and CoIP'和'Immunofluorescence'，以及Figure 4 |
| 裸鼠异种移植瘤实验 | 动物：雌性BALB/c裸鼠（4-5周龄），细胞数（2×10^6细胞/100 µL PBS），注射部位（右腋窝），肿瘤体积公式，观察时间（21天） 阅读提示：参见Materials and Methods中的'Xenografts in nude mice'和Figure 5 |