单细胞RNA测序分析
探究BAS患者肉芽组织中cGAS-STING通路的表达和细胞异质性
对3例正常气管组织和4例BAS肉芽组织进行scRNA-seq，共捕获58,586个细胞，鉴定出14种细胞类型，分析cGAS-STING通路评分。
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巨噬细胞STING信号通过IL6-STAT3通路促进良性气道狭窄的纤维化
Macrophage STING signaling promotes fibrosis in benign airway stenosis via an IL6-STAT3 pathway.
实验完整度
高包含scRNA-seq、小鼠BAS模型、STING敲除、巨噬细胞耗竭、细胞共培养及多种抑制剂处理，涵盖体外和体内功能及机制验证。
主要模型
小鼠良性气道狭窄模型（气管刷伤） BMDM巨噬细胞 小鼠气管成纤维细胞 小鼠肺上皮细胞MLE12
重点核对
小鼠模型：C57BL/6J小鼠，8周龄，气管刷伤诱导BAS STING抑制剂C176给药剂量：5 mg/kg，腹腔注射，术前2小时及术后第2、4、6天 巨噬细胞耗竭：氯膦酸脂质体200 μl术前6小时静脉注射，术后第2、4、6天150 μl DNA转染：使用Lipofectamine 3000转染小鼠气管DNA
摘要
急性和慢性炎症是良性气道狭窄（BAS）纤维化的重要病理过程，BAS是危重患者的常见并发症。cGAS-STING信号在炎症和纤维化中具有重要作用，但STING在BAS中的功能仍不清楚。在此，我们通过单细胞RNA测序证明cGAS-STING信号参与BAS，并伴随dsDNA增加、STING表达和激活。STING抑制或缺陷通过减少急性和慢性炎症有效缓解BAS小鼠的气管纤维化。巨噬细胞耗竭也能有效改善BAS。机制上，受损上皮细胞释放的dsDNA激活巨噬细胞的cGAS-STING通路，诱导IL-6激活STAT3从而促进纤维化。总之，本研究结果表明cGAS-STING信号诱导急性炎症并放大与良性气道狭窄相关的慢性炎症和气管纤维化，突出了BAS的机制和潜在药物靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- STING信号是否参与良性气道狭窄（BAS）的纤维化过程，以及其机制是什么？
- 核心机制
- 气管损伤释放的dsDNA激活巨噬细胞中的cGAS-STING通路，诱导IL-6产生，IL-6通过IL6-STAT3轴激活成纤维细胞，促进纤维化。
- 主要证据
- scRNA-seq显示BAS患者肉芽组织中cGAS-STING通路激活，小鼠模型中抑制STING或巨噬细胞耗竭减轻纤维化，体外共培养实验证实巨噬细胞通过IL-6激活成纤维细胞STAT3。
- 研究意义
- cGAS-STING通路可能是预防良性气道狭窄的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠BAS模型建立及表型分析
验证cGAS-STING通路在BAS发病中的作用
使用小刷子刮伤小鼠气管建立BAS模型，通过组织学、dsDNA检测、Western blot等评估病理变化和STING通路激活。
STING抑制或基因敲除实验
确定STING在BAS进展中的功能
给予STING抑制剂C176（5 mg/kg，腹腔注射）或使用STING KO小鼠，观察对气管纤维化的影响。
巨噬细胞耗竭实验
验证巨噬细胞在BAS纤维化中的必要性
使用氯膦酸脂质体耗竭巨噬细胞，评估对气管纤维化、炎症和STAT3通路的影响。
体外细胞实验
验证dsDNA激活巨噬细胞STING通路并通过IL-6促进成纤维细胞活化
用死亡上皮细胞上清或小鼠气管DNA转染BMDMs，检测STING磷酸化和IL-6分泌，并与成纤维细胞共培养观察STAT3和αSMA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | C176 | Selleck | S6575 |
| RU.521 | Med-Chem Express | HY-114180 | |
| Stattic | Med-Chem Express | HY-13818 | |
| 抗小鼠IL6单克隆抗体 | Selleck | A2118 | |
| 重组小鼠IL6 | Med-Chem Express | HY-P7063 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30406.05 | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Med-Chem Express | HY-P7085 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| DNA提取 | 组织DNA提取迷你试剂盒 | Vazyme | DC102 |
| dsDNA检测 | Picogreen双链DNA定量试剂 | YEASEN | 12640ES60 |
| RNA提取 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Vazyme | RC112 |
| 逆转录 | 一步法iScript cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R323 |
| qRT-PCR | SYBR green预混液 | Vazyme | Q711 |
| Western blot | 蛋白质分子量标准 | Epizyme | WJ103 |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗磷酸化STING (Ser365)抗体 | Cell Signaling Technology | 72971 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 38066 | |
| 抗磷酸化TBK1 (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗αSMA抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| 抗I型胶原抗体 | Abcam | ab316222 | |
| 抗cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | 31659 | |
| 抗AIM2抗体 | Cell Signaling Technology | 63660S | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| Tanon 5200化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗磷酸化Stat3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 |
| 抗磷酸化STING (Ser366)抗体 | Cell Signaling Technology | 50907 | |
| 免疫荧光 | 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 78827 |
| 抗磷酸化STING (Ser365)抗体 | Cell Signaling Technology | 62912 | |
| 抗F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 30325 | |
| 抗cGAS抗体 | Proteintech | 29958-1-AP | |
| 抗磷酸化组蛋白H2A.X (Ser139)抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| 抗IL-6抗体 | Cell Signaling Technology | 12912 | |
| dsDNA标记抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58749 | |
| 流式细胞术 | 活/死细胞染色剂 | BD Biosciences | 564406 |
| BD固定/透化试剂盒 | BD Pharmingen | 554714 | |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 557659 | |
| 抗CD11b抗体 | BD Biosciences | 552850 | |
| 抗F4/80抗体 | BD Biosciences | 565411 | |
| 抗STING抗体 (AF488标记) | Cell Signaling Technology | 78827S | |
| 细胞因子检测 | Luminex多重细胞因子检测试剂盒 | BIO-RAD | 12009159 |
| ELISA | IL6 ELISA试剂盒 | LIANKE | EK206 |
| 琼脂糖凝胶电泳 | 琼脂糖 | Abclone | RM02852 |
| DNA上样缓冲液 | Abclone | RK30151 | |
| DNA分子量标准 | Abclone | RK30192 | |
| Tanon 3500B全自动凝胶图像分析系统 | Tanon | -- | |
| RNA-seq建库 | Trizol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 |
| Bioanalyzer 2100分析仪 | Agilent | -- | |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent | 5067-1511 | |
| Dynabeads Oligo (dT)磁珠 | Thermo Fisher | -- | |
| 镁离子RNA片段化模块 | NEB | e6150 | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 1896649 | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | m0209 | |
| RNase H | NEB | m0297 | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher | R0133 | |
| 热不稳定UDG酶 | NEB | m0280 | |
| RNA测序 | Illumina Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium单细胞3'试剂盒(V3) | 10x Genomics | -- |
| 显微CT | 微型CT扫描仪 | PINGSENG Healthcare | -- |
| 肺功能 | 无创全身体积描记系统 | TOW | WBP-4MR |
| 细胞因子检测 | Luminex X-200检测仪 | Luminex | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠BAS模型 | C57BL/6J小鼠，8周龄，气管刷伤方式（1mm小刷刮擦3次） 阅读提示：Methods: Surgical procedure |
| STING抑制实验 | C176剂量5 mg/kg，腹腔注射，术前2h及术后第2、4、6天 阅读提示：Methods: Drug administration |
| 巨噬细胞耗竭实验 | 氯膦酸脂质体剂量：术前6h 200μl，术后第2、4、6天150μl，静脉注射 阅读提示：Methods: Drug administration |
| 体外细胞实验 | BMDM分化条件、气管DNA转染（Lipofectamine 3000）、共培养体系 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |