克隆mTwist1和hTWIST1
验证mTwist1和hTWIST1的克隆及蛋白表达
从H9C2和MDA-MB-231细胞cDNA中扩增mTwist1和hTWIST1的ORF，克隆到pLenti-CMV-MCS-BLAST载体，瞬时转染293FT细胞，Western blot检测表达。
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在MCF10A细胞中构建强力霉素诱导的上皮-间质转化模型系统
Constructing a doxycycline-inducible system for an epithelial-to-mesenchymal transition model in MCF10A cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型、DOX诱导系统、功能验证（EMT标志物检测）和机制验证（可逆性及与TGFβ1比较），证据层级多元。
主要模型
MCF10A细胞 293FT细胞 单克隆iMCF10A-mTwist1-H4细胞
重点核对
DOX浓度：1 μg/ml 细胞传代密度：3.5×10^5 cells/6 cm dish，每3天传代 mTwist1表达稳定性：单克隆细胞在DOX处理21天内保持稳定 EMT标志物变化：epithelial markers (CDH1, JUP, OCLN) 下降，mesenchymal markers (CDH2, VIM, FN1) 上升 撤去DOX后EMT逆转：12天内恢复上皮表型
摘要
上皮-间质转化（EMT）已被证明在癌症细胞侵袭和转移的早期阶段发挥重要作用。可诱导的EMT模型能够以受控方式启动EMT，从而为确定癌症相关基因是否通过触发EMT来影响癌症转移提供机会。此外，不同的可诱导EMT模型能够研究各种基因对EMT调节的特定机制，有助于更精确地理解这些基因如何通过诱导EMT影响癌症转移。不幸的是，目前的可诱导EMT模型仍存在未满足的需求。因此，我们旨在通过操纵小鼠Twist1（mTwist1）的表达，在MCF10A细胞（一种自发永生化的人纤维囊性乳腺细胞系）中建立可诱导的EMT模型。在本研究中，我们首先比较了人TWIST1（hTWIST1）和mTwist1的EMT诱导能力，并选择mTwist1进行进一步研究。通过监测不同诱导时间点上皮和间充质标志物的变化，我们检查了表达强力霉素（DOX）诱导型mTwist1的多克隆和单克隆MCF10A细胞中的EMT过程。此外，我们的结果表明，强力霉素诱导的mTwist1表达触发EMT的速度与TGFβ1诱导的MCF10A细胞EMT相似。另外，这个过程在撤去DOX后是可逆的。因此，我们在MCF10A细胞中建立了一个稳健的可诱导EMT模型，可用于进一步研究癌症转移驱动基因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在MCF10A细胞中建立一个稳健且可逆的、由mTwist1驱动的诱导型EMT模型，以便研究癌症转移驱动基因。
- 核心机制
- DOX诱导的mTwist1表达通过下调上皮标志物（CDH1, JUP, OCLN）和上调间充质标志物（CDH2, VIM, FN1）驱动EMT，且该过程在撤去DOX后逆转。
- 主要证据
- 通过比较hTWIST1和mTwist1的EMT诱导能力（图2），建立DOX诱导的多克隆和单克隆细胞系，检测EMT标志物变化（qRT-PCR、Western blot、免疫荧光），并验证EMT的可逆性（图6）。
- 研究意义
- 该模型有助于研究癌症转移驱动基因及其对Twist1介导的EMT的影响，为癌症转移机制研究提供工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较mTwist1和hTWIST1的EMT诱导能力
评估两种蛋白在MCF10A细胞中诱导EMT的能力是否相同
分别构建稳定表达mTwist1或hTWIST1的MCF10A细胞系（sMCF10A-mTwist1和sMCF10A-hTWIST1），观察细胞形态、检测EMT标志物（qRT-PCR、Western blot、免疫荧光）。
构建DOX诱导型多克隆iMCF10A-mTwist1细胞系
建立DOX诱导的mTwist1表达系统并观察EMT进程
将mTwist1克隆到pLVX-TetOne载体，转导MCF10A细胞，用DOX处理，每3天传代，监测不同时间点的EMT标志物变化。
验证多克隆细胞EMT的可逆性
检测多克隆iMCF10A-mTwist1细胞在持续DOX处理下EMT是否稳定
将多克隆细胞持续DOX处理至18天，检测EMT标志物和CDH1表达，发现EMT部分逆转。
筛选单克隆iMCF10A-mTwist1细胞系
获得EMT诱导稳定且持续的细胞克隆
通过有限稀释法在96孔板中分离单克隆，用blasticidin-S筛选，选择DOX处理后mTwist1高表达的克隆（如H4, A11, A7），并进行EMT诱导实验。
与TGFβ1诱导EMT模型比较
比较Twist1模型与TGFβ1模型的EMT诱导特征
用5 ng/ml TGFβ1处理MCF10A细胞超过两周，收集不同时间点细胞，检测EMT标志物，与Twist1模型比较。
验证EMT的可逆性（撤去DOX）
验证单克隆iMCF10A-mTwist1-H4细胞在撤去DOX后EMT是否逆转
将已发生EMT的H4细胞在不含DOX的培养基中培养，观察细胞形态和EMT标志物表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Procell | PM150310 |
| 马血清 | Gibco | 16050122 | |
| 人表皮生长因子 | Novoprotein | C029 | |
| 氢化可的松 | APExBIO | B1951 | |
| 人重组胰岛素 | Novoprotein | NC005 | |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052 | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| 高糖DMEM培养基 | Gibco | 12800-017 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 载体构建 | pLenti-CMV-MCS-BLAST载体 | HedgehogBio Science and Technology Ltd | -- |
| pLVX-TetOne-BLAST载体 | HedgehogBio Science and Technology Ltd | -- | |
| 细胞系构建 | 杀稻瘟菌素S | Beyotime | ST018 |
| EMT诱导 | 强力霉素 | Beyotime | ST039A |
| 转化生长因子β1 | Novoprotein | CA59 | |
| qRT-PCR | 总RNA提取试剂 | Vazyme | R401-01 |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | YEASEN | 11139ES10 | |
| 2×SYBR Green预混液 | YEASEN | 11201ES08 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Proteintech | PR20016 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Proteintech | PR20015 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| 预染蛋白分子量标准 | Proteintech | PL00001 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL检测试剂 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | 9048-46-8 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | -- | 3195 | |
| CY3标记的山羊抗兔抗体 | Proteintech | SA00009-2 | |
| DAPI | YEASEN | 40728ES03 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| 尼康Eclipse 80i显微镜 | Nikon | -- | |
| Western blot | ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- |
| qRT-PCR | Bio-Rad CFX connect光学模块 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | MCF10A细胞培养基成分、血清浓度、生长因子添加 阅读提示：Methods: Cell cultures |
| EMT诱导（DOX） | DOX浓度为1 μg/ml，细胞每3天传代，密度3.5×10^5 cells/6 cm dish 阅读提示：Methods: Cell line generation and EMT induction, Figure legends 3 |
| EMT诱导（TGFβ1） | TGFβ1浓度为5 ng/ml，细胞每3天传代，密度3.0×10^5 cells/6 cm dish 阅读提示：Methods: Cell line generation and EMT induction, Figure S6 |
| 单克隆筛选 | blasticidin-S浓度10 μg/ml，96孔板有限稀释，选择高表达mTwist1克隆 阅读提示：Methods: Cell line generation and EMT induction |
| EMT可逆性验证 | 撤去DOX后培养时间（6天和12天），观察细胞形态和标志物变化 阅读提示：Figure 6 legend, Results: EMT is reversible after DOX withdrawal |