评价榄香烯在PDX模型中的抗肿瘤效果
评估榄香烯对非小细胞肺癌患者来源异种移植模型的肿瘤生长抑制作用。
将患者肺癌组织处理后接种于NYG小鼠建立PDX模型，每日给予榄香烯100 mg/kg，测量肿瘤体积和重量，并通过Western blot和KEGG分析验证NF-κB通路相关蛋白表达。
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榄香烯作为microRNA-145-5p的结合稳定剂抑制非小细胞肺癌的生长
Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内CDX/PDX模型、患者样本、高通量测序及多层面机制验证。
主要模型
A549、H460、H322、H1299人肺癌细胞系 患者来源异种移植（PDX）模型 A549细胞异种移植（CDX）模型 BALB/c裸鼠
重点核对
榄香烯处理浓度：0、5、10、25 μg/mL（体外） PDX模型中榄香烯给药剂量：100 mg/kg每日 CDX模型中榄香烯给药剂量：50和100 mg/kg每日 miR-145-5p过表达和抑制的稳定细胞系构建 KD值：miR-145-5p WT与榄香烯结合KD = 0.39 ± 0.17 μg/mL
摘要
榄香烯被广泛认为是一种有效的抗癌化合物，并在中国的临床环境中常规用于治疗包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种实体瘤。然而，其详细的分子机制尚未被充分证明。在本研究中，证明了榄香烯在患者来源的异种移植（PDX）模型中有效抑制了NSCLC的生长。机制上，通过高通量筛选技术和随后的生化验证如微量热泳动（MST），microRNA-145-5p（miR-145-5p）被确定为榄香烯发挥其抗肿瘤作用的关键靶点。有趣的是，榄香烯作为miR-145-5p的结合稳定剂，表现出强大的结合亲和力（解离常数（KD）= 0.39 ± 0.17 μg/mL），并在体外和体内防止其降解，同时不影响初级microRNA转录本（pri-miRNAs）和前体miRNAs（pre-miRNAs）的合成。榄香烯对miR-145-5p的稳定化导致该miRNA水平升高，随后通过miR-145-5p/丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（MAP3K3）/核因子κB（NF-κB）通路抑制NSCLC进展。我们的发现为揭示临床抗肿瘤药物与miRNAs之间的相互作用模式提供了新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 榄香烯如何通过miRNA发挥抗非小细胞肺癌作用，其分子机制是什么？
- 核心机制
- 榄香烯通过结合miR-145-5p的3'末端胞嘧啶，增强其稳定性并防止其降解，导致miR-145-5p积累，进而靶向抑制MAP3K3表达，降低NF-κB通路活性，抑制NSCLC进展。
- 主要证据
- PDX和CDX模型显示榄香烯抑制肿瘤生长；体外实验显示榄香烯抑制细胞活力、诱导凋亡和细胞周期阻滞；MST和分子模拟显示榄香烯直接结合miR-145-5p；双荧光素酶报告基因和Western blot验证miR-145-5p靶向MAP3K3并调控NF-κB通路；体内实验证实miR-145-5p介导榄香烯的抗肿瘤作用。
- 研究意义
- 该研究首次揭示榄香烯通过miR-145-5p/MAP3K3/NF-κB轴抑制肿瘤生长的机制，为基于miRNA的天然抗肿瘤化合物开发提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
研究榄香烯对NSCLC细胞增殖、凋亡、迁移和细胞周期的影响。
使用A549、H460、H322、H1299细胞系，经不同浓度榄香烯处理48小时，进行CCK-8、流式细胞术、克隆形成、划痕实验及Western blot检测相关蛋白。
验证NF-κB通路抑制
验证榄香烯是否通过抑制NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用。
通过Western blot检测p-p65、p-IκBα等蛋白水平，免疫荧光和Western blot分析p65/p50核转位，ChIP和GST pull-down检测p65/p50与COX-2启动子结合。
筛选并验证miR-145-5p为关键靶点
识别榄香烯处理下表达变化的miRNA并确定关键候选miRNA。
通过miRNA-seq分析差异表达miRNA，与三个数据库比对后筛选出9个肺癌相关miRNA，qPCR验证miR-145-5p上调最显著，进一步在TCGA数据库中分析其表达与预后的关系。
构建miR-145-5p稳定细胞系并进行功能验证
验证miR-145-5p对NSCLC细胞增殖和炎症因子的影响。
通过慢病毒感染A549细胞建立miR-145-5p过表达和抑制的稳定细胞系，使用xCELLigence RTCA、克隆形成、划痕实验检测增殖迁移，Western blot检测炎症蛋白。
体内验证miR-145-5p功能
验证miR-145-5p在体内对肿瘤生长的抑制作用。
将A549-LV-miR-145-5p或对照细胞皮下接种裸鼠，测量肿瘤体积和重量，通过IHC和Western blot检测相关蛋白。
验证MAP3K3为miR-145-5p靶基因
确定miR-145-5p的下游靶基因及调控机制。
通过生物信息学预测和qRT-PCR验证MAP3K3和ADAM17，双荧光素酶报告基因实验验证miR-145-5p与MAP3K3 3'-UTR结合，Western blot检测MAP3K3表达及NF-κB通路活性。
验证榄香烯通过miR-145-5p发挥抗肿瘤作用
验证榄香烯的抗肿瘤作用是否依赖miR-145-5p。
在体外，敲减miR-145-5p逆转了榄香烯导致的MAP3K3抑制和克隆形成减少；在体内，使用LV-anti-miR-145-5p敲低miR-145-5p后，恢复MAP3K3表达和NF-κB活性，逆转榄香烯抑制的肿瘤生长。
机制研究：榄香烯稳定miR-145-5p
阐明榄香烯如何增加miR-145-5p水平。
通过qPCR和Northern blot检测成熟miR-145-5p和pri/pre-miRNA水平，使用放线菌素D实验评估miRNA稳定性，体外降解实验和MST分析结合亲和力，分子模拟预测结合位点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Pricella Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Meilun Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Pricella Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| DMEM/F12培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | 文中未明确说明 | -- |
| 流式细胞术 | 细胞周期检测试剂盒 | Jiangsu KeyGEN BioTECH Corp., Ltd. | KGA511 |
| 凋亡检测试剂盒 | Jiangsu KeyGEN BioTECH Corp., Ltd. | KGA108 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | 文中未明确说明 | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Western Bright ECL化学发光液 | Tanon Science and Technology Co., Ltd. | -- | |
| 磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| COX-2抗体 | Cell Signaling Technology | 12282 | |
| MAP3K3抗体 | Cell Signaling Technology | 5727 | |
| IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 4812 | |
| 磷酸化IκBα (Ser32)抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| IL-6抗体 | Cell Signaling Technology | 12153 | |
| Cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| Cleaved caspase-9抗体 | Cell Signaling Technology | 9509 | |
| Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 3498 | |
| Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 5023 | |
| NF-κB1 p105/p50抗体 | Cell Signaling Technology | 13586 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-1g | |
| TNF-α抗体 | ABclonal Technology | A24214 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Hunan Aikerui Bioengineering Co., Ltd. | -- |
| pull-down | 链霉亲和素偶联琼脂糖珠 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| β-甘油磷酸 | MedChemExpress | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Merck | -- | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 原代细胞分离 | IV型胶原酶 | Solarbio | -- |
| Northern blot | DIG Northern Starter试剂盒 | Roche | -- |
| CDP-Star化学发光底物 | Roche | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO双荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 细胞活力检测 | 榄香烯 | -- | -- |
| 细胞稳定转染 | miR-145-5p过表达慢病毒载体 | GeneCopoeia | HmiR0085-MR03 |
| miR-145-5p抑制慢病毒载体 | GeneCopoeia | HmiR-AN0192-MR04 | |
| MST | Cy5标记RNA (miR-145 WT) | Sangon Biotech | -- |
| Cy5标记RNA (miR-145 MUT) | Sangon Biotech | -- | |
| 微量热泳动仪 | NanoTemper | -- | |
| 细胞活力检测 | 酶标仪 | PerkinElmer | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Agilent Technologies | -- |
| qRT-PCR | 紫外分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞增殖实时监测 | xCELLigence RTCA系统 | ACEA Biosciences, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源、培养基成分、榄香烯浓度范围（0、5、10、25 μg/mL）和处理时间（48小时） 阅读提示：查看Materials and methods的2.1、2.2节以及图2A的图注 |
| 体外功能实验 | CCK-8细胞接种密度（5000细胞/孔）、细胞周期和凋亡染色试剂盒用法、流式细胞术参数 阅读提示：查看Materials and methods的2.2、2.3节 |
| 体内模型 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）、周龄（5周）、性别（雄性）、接种细胞数量（1×10^6）和给药剂量（10或100 mg/kg每日） 阅读提示：查看Materials and methods的2.13、2.14节及图1的图注 |
| miRNA调控机制 | 稳定细胞系构建的关键载体（HmiR0085-MR03和HmiR-AN0192-MR04）、polybrene浓度（8 μg/mL）、actinomycin D实验条件、MST结合实验的RNA序列和仪器设置 阅读提示：查看Materials and methods的2.4、2.5、2.15节及图6的图注 |
| 分子靶标验证 | 双荧光素酶报告基因的质粒构建（pmirGLO-MAP3K3-WT/MUT）、转染细胞类型（293T）和检测时间（48小时） 阅读提示：查看Materials and methods的2.12节及图4的图注 |