FGF18在病理性心脏肥大中的表达分析
明确FGF18在病理性心脏肥大中的表达变化及其与氧化应激的关系。
分析GSE18801数据集，检测ISO处理或游泳诱导小鼠心脏中FGF基因表达；构建TAC模型，检测FGF18 mRNA和蛋白水平；使用ISO处理NRCMs，检测FGF18表达。
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成纤维细胞生长因子18减轻雄性小鼠应激诱导的病理性心脏肥大
Fibroblast growth factor 18 alleviates stress-induced pathological cardiac hypertrophy in male mice.
实验完整度
高包含体外心肌细胞、体内TAC模型、基因敲除/过表达及机制验证等多个独立证据层级。
主要模型
新生大鼠心肌细胞（NRCMs） 成年小鼠心肌细胞 C57BL/6J小鼠TAC模型 Fgf18+/−和Fgf18-CKO小鼠
重点核对
小鼠品系：C57BL/6J雄性，6周龄 TAC手术：0.35mm缩窄，术后6周 AAV9注射剂量：1×10^12 vg/只 ISO浓度：10μM，处理48小时 FGF18重组蛋白浓度：50ng/mL
摘要
成纤维细胞生长因子-18（FGF18）具有多种器官发育和损伤修复作用。然而，其在肥厚刺激后心脏稳态中的作用仍不清楚。在此，我们研究了FGF18在压力超负荷（PO）诱导的病理性心脏肥大中的调控和功能。FGF18杂合（Fgf18+/−）和诱导性心肌细胞特异性FGF18敲除（Fgf18-CKO）雄性小鼠暴露于横向主动脉缩窄（TAC）后表现出加剧的病理性心脏肥大，伴有氧化应激增加、心肌细胞死亡、纤维化和功能障碍。相反，心脏特异性过表达FGF18可减轻肥大，降低氧化应激，减弱心肌细胞凋亡，并改善纤维化和心脏功能。通过生物信息学分析、LC-MS/MS和实验验证，确定了FGF18的下游因子酪氨酸蛋白激酶FYN。机制研究表明，FGF18/FGFR3促进FYN活性和表达，并负调控NADPH氧化酶4（NOX4），从而抑制活性氧（ROS）生成并减轻病理性心脏肥大。这项研究揭示了FGF18通过FYN/NOX4信号轴维持氧化还原稳态介导的心脏保护作用，提示其可能成为治疗心脏肥大的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FGF18在病理性心脏肥大中的作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- FGF18通过与FGFR3结合，促进FYN的活化和表达，进而负调控NOX4活性，抑制ROS生成，减轻氧化应激，从而缓解病理性心脏肥大。
- 主要证据
- 体外实验显示FGF18过表达抑制ISO诱导的NRCMs肥大、氧化应激和凋亡；体内实验显示FGF18过表达减轻TAC诱导的小鼠心脏肥大、纤维化和功能障碍；FGF18缺失（Fgf18+/−和Fgf18-CKO）加剧上述病理过程；机制实验证实FGF18/FGFR3激活FYN，且FYN/NOX4相互作用为保护作用所必需。
- 研究意义
- 本研究揭示了FGF18在病理性心脏肥大中的心脏保护作用，为心脏肥大提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FGF18过表达对心肌细胞肥大的体外保护作用
评估FGF18过表达对ISO诱导的心肌细胞肥大、氧化应激和凋亡的影响。
用Ad-FGF18或Ad-LacZ感染NRCMs，ISO处理48小时，检测细胞大小、肥大标志物、ROS、凋亡等指标。
FGF18过表达对小鼠TAC诱导心脏肥大的体内保护作用
验证心肌细胞特异性FGF18过表达对压力超负荷诱导的心脏肥大的保护作用。
通过尾静脉注射AAV9-cTnT-FGF18（或对照AAV9-LacZ）至6周龄雄性C57BL/6J小鼠，2周后进行TAC手术，6周后评估心脏结构和功能。
FGF18缺失对心脏肥大的影响
确定FGF18缺失是否加剧病理性心脏肥大。
使用Fgf18+/−和Fgf18-CKO小鼠，进行TAC手术，观察心脏肥大、纤维化、氧化应激等表型。
FGF18下游机制研究：FYN的鉴定与验证
鉴定FGF18下游关键因子并验证其作用。
通过LC-MS/MS分析FGF18处理后的NRCMs差异蛋白，发现FYN；免疫共沉淀验证FGFR3与FYN相互作用及FYN磷酸化。
FYN在FGF18保护作用中的必要性验证
验证FYN是否为FGF18心脏保护作用所必需。
使用腺病毒介导的FYN shRNA敲低NRCMs中的FYN，或通过AAV9-cTnT-sh-FYN在小鼠心肌细胞中敲低FYN，观察FGF18过表达的保护作用是否被取消。
FYN过表达对Fgf18-CKO小鼠心脏肥大的部分挽救
验证FYN过表达能否部分逆转FGF18缺失导致的心脏肥大。
在Fgf18-CKO小鼠中通过AAV9-cTnT-FYN过表达FYN，进行TAC手术，观察心脏表型是否改善。
FGF18通过FYN/NOX4轴抑制ROS的机制验证
阐明FGF18通过FYN/NOX4轴抑制ROS的具体机制。
检测FGF18对FYN-NOX4相互作用、p22phox-NOX4相互作用的影响；使用GKT137831抑制NOX4活性，验证其对FGF18保护作用的替代效应；使用FYN1-80突变体干扰FYN-NOX4相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Santa Cruz Biotechnology | sc-208414 |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | 11330032 |
| 胎牛血清 | Gibo | 16010159 | |
| Percoll分离液 | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| 胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C919 | |
| 药物处理 | GKT137831 | Selleck | 1218942-37-0 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
| Western blot | Pierce BCA蛋白检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | 23228 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Tris缓冲盐溶液 | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| 吐温20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| HRP标记山羊抗小鼠二抗 | Abcam | ab6789 | |
| HRP标记山羊抗兔二抗 | Abcam | ab6721 | |
| Pierce ECL plus Western blot底物 | Thermo Fisher Scientific | 32132 | |
| p-p38抗体 | CST | 4511 | |
| p38抗体 | CST | 8690 | |
| p-Erk抗体 | CST | 9101 | |
| Erk抗体 | CST | 9102 | |
| p-JNK抗体 | CST | 4668 | |
| JNK抗体 | Abcam | ab179461 | |
| Bax抗体 | CST | 2772 | |
| Bcl-2抗体 | Santa cruz | sc-7382 | |
| FGF1抗体 | Abcam | ab207321 | |
| FGF2抗体 | Santa cruz | sc-74412 | |
| FGF3抗体 | Santa cruz | sc-135 | |
| FGF5抗体 | Santa cruz | sc-376264 | |
| FGF9抗体 | Santa cruz | sc-373716 | |
| FGF13抗体 | Affinity biosciences | DF4699 | |
| FGF16抗体 | Santa cruz | sc-390547 | |
| FGF18抗体 | Santa cruz | sc-393471 | |
| FGFR3抗体 | Santa cruz | sc-390423 | |
| FYN抗体 | Santa cruz | sc-365913 | |
| p-Src抗体 | CST | 2101 | |
| 3-硝基酪氨酸抗体 | Abcam | ab61392 | |
| NOX4抗体 | Origene | TA349083 | |
| p22phox抗体 | Santa cruz | sc-271968 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 免疫沉淀 | IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 |
| 亮抑酶肽 | Sigma-Aldrich | L5793 | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | SRE0050 | |
| PureProteome蛋白A/G混合磁珠 | Merck Millipore | LSKMAGAG10 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | Cell Signaling Technology | 5415 | |
| 兔IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| 组织学 | 麦胚凝集素-Alexa488 | Thermo Fisher Scientific | W11261 |
| DAPI | -- | -- | |
| 天狼星红 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Solarbio | BC0255 | |
| 腺病毒构建 | pBHGloxΔE1, 3 Cre质粒 | Microbix | PD-01-40 |
| pDC316穿梭载体 | Microbix | PD-01-28 | |
| HEK293T细胞 | Procell Life Science & Technology | CL-0005 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| shRNA构建 | pSilencer 2.1-U6表达载体 | Ambion | AM5762 |
| pDC311载体 | Microbix | PD-01-25 | |
| 氧化应激检测 | 二氢乙啶 | Thermo Fisher Scientific | D11347 |
| Amplex Red试剂 | Invitrogen | -- | |
| 辣根过氧化物酶 | -- | -- | |
| DCFH-DA荧光探针 | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Takara Bro Inc | 9108 |
| Hiscript III逆转录试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| TUNEL | DeadEnd荧光TUNEL系统 | Promega | G3250 |
| LC-MS/MS | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| LTQ Velos Pro质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Proxeon纳喷雾离子源 | -- | -- | |
| 超声心动图 | Vevo 1100超声系统 | VisualSonics | -- |
| Vevo LAB软件 | VisualSonics | -- | |
| 显微镜 | Nikon Eclipse Ni光学显微镜 | Nikon | -- |
| Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 荧光检测 | Mithras LB 940酶标仪 | Berthold Technologies | -- |
| 分析软件 | ImageQuant 5.2软件 | Molecular Dynamics | -- |
| ImagePro Plus软件 | Media Cybernetics | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| GraphPad Prism 8软件 | GraphPad Software | -- | |
| SPSS软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、TAC手术缩窄程度、术后观察时间 阅读提示：Methods: Animal procedures; Transverse aortic constriction (TAC) |
| 心肌细胞培养与处理 | NRCMs分离方法、ISO浓度和处理时间、FGF18处理浓度、腺病毒MOI 阅读提示：Methods: Isolation and culture of neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs) |
| 基因敲除与过表达 | 他莫昔芬注射剂量和频率、AAV9注射剂量和时间点、shRNA靶序列 阅读提示：Methods: Animal procedures; Adeno-associated virus production |
| 氧化应激检测 | ROS检测探针浓度和孵育时间、氢 peroxide检测试剂盒、样品准备 阅读提示：Methods: Oxidative stress measurement |