RNA-seq分析
鉴定OSBPL2缺失影响的基因和通路
对Osbpl2-KO和WT OC1细胞进行转录组测序，分析差异表达基因，进行GO和KEGG通路富集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
听觉细胞中OSBPL2的缺失增加胆固醇生物合成并通过抑制AMPK活性驱动活性氧产生
Deletion of OSBPL2 in auditory cells increases cholesterol biosynthesis and drives reactive oxygen species production by inhibiting AMPK activity.
实验完整度
高包含体外细胞模型（OC1）和体内动物模型（斑马鱼）两个证据层级，且包括功能验证（AMPK调控、胆固醇合成）和机制验证（蛋白互作）。
主要模型
OC1听觉细胞系 osbpl2b-KO斑马鱼
重点核对
OC1细胞和斑马鱼内耳中AMPK Thr172磷酸化水平 Srebp2核转位及Hmgcr、Hmgcs1表达 总胆固醇含量测定 ROS水平检测
摘要
氧固醇结合蛋白样2（OSBPL2）被确定为常染色体显性非综合征性听力损失的新型致病基因。然而，OSBPL2缺乏在ADNSHL中的发病机制仍不清楚。OSBPL2作为脂质感应调节因子在多种细胞过程中的功能表明，OSBPL2可能在胆固醇稳态的调节中发挥重要作用，而胆固醇稳态对内耳至关重要。在本研究中，在Osbpl2-KO OC1细胞和osbpl2b-KO斑马鱼中研究了OSBPL2在胆固醇生物合成和ROS产生中的潜在作用。基于RNA-seq的分析表明OSBPL2与胆固醇生物合成和AMPK信号通路有关。此外，Osbpl2/osbpl2b-KO导致AMPK活性降低，以及甾醇生物合成途径中与AMPK信号相关的关键基因Srebp2/srebp2、Hmgcr/hmgcr和Hmgcs1/hmgcs1的表达上调。此外，还发现OSBPL2与AMPK的关键激活因子ATIC相互作用。在Osbpl2/osbpl2b-KO突变体中，OC1细胞或斑马鱼内耳的总胆固醇和ROS水平均升高，并且在Osbpl2-KO OC1细胞中检测到线粒体损伤。本研究揭示了OSBPL2在细胞胆固醇生物合成和ROS产生中的调节作用。这些发现可能有助于深入理解OSBPL2突变在ADNSHL中的发病机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- OSBPL2缺乏如何影响听觉细胞和斑马鱼内耳的胆固醇稳态及活性氧产生？
- 核心机制
- OSBPL2缺乏破坏与ATIC的相互作用，降低AICAR水平，抑制AMPK活性，导致SREBP2核转位增加，上调HMGCR和HMGCS1，促进胆固醇生物合成，进而增加ROS并引起线粒体损伤。
- 主要证据
- RNA-seq显示胆固醇生物合成和AMPK信号通路富集；Western blot显示AMPK磷酸化降低，Srebp2、Hmgcr、Hmgcs1上调；Co-IP和GST pull-down验证OSBPL2-ATIC相互作用；胆固醇和ROS测定显示水平升高；TEM显示线粒体损伤。
- 研究意义
- 揭示OSBPL2在胆固醇稳态中的新功能，为理解OSBPL2突变导致ADNSHL的发病机制提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证AMPK活性和胆固醇合成相关蛋白表达
验证OSBPL2缺失对AMPK信号通路和胆固醇合成的影响
通过Western blot检测AMPK及其磷酸化水平、ACC磷酸化、Srebp2前体和核形式、Hmgcr、Hmgcs1的表达。
总胆固醇含量测定
检测OSBPL2缺失对细胞内总胆固醇水平的影响
使用试剂盒测定细胞和组织中的总胆固醇含量。
AMPK功能验证
证实AMPK活性抑制对胆固醇合成的影响
使用AMPK抑制剂Compound C、激活剂AICAR、siRNA敲低和过表达质粒处理OC1细胞，检测AMPK磷酸化、胆固醇合成相关蛋白和总胆固醇水平。
OSBPL2与ATIC相互作用验证
确定OSBPL2与ATIC的相互作用及其结构域
通过Co-IP和GST pull-down实验验证OSBPL2与ATIC及其截短体的结合。
AICAR水平测定
检测OSBPL2缺失对AICAR水平的影响
使用ELISA试剂盒测定OC1细胞中AICAR含量。
ROS水平和线粒体功能检测
评估胆固醇积累对ROS产生和线粒体功能的影响
使用DCFDA或CellROX Deep Red染色检测ROS水平，通过TEM观察线粒体超微结构，用JC-1探针检测线粒体膜电位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体孵育 | AMPK抗体 #2793 | Cell Signaling Technology | #2793 |
| Flag标签抗体 #2368 | Cell Signaling Technology | #2368 | |
| His标签抗体 #12698 | Cell Signaling Technology | #12698 | |
| GST标签抗体 #2624 | Cell Signaling Technology | #2624 | |
| GAPDH抗体 #5174 | Cell Signaling Technology | #5174 | |
| 磷酸化AMPK (Thr172)抗体 #2535 | Cell Signaling Technology | #2535 | |
| HMGCR抗体 ab174830 | Abcam | ab174830 | |
| ATIC抗体 ab188321 | Abcam | ab188321 | |
| HA标签抗体 ab1424 | Abcam | ab1424 | |
| 磷酸化ACC (Ser79)抗体 ab68191 | Abcam | ab68191 | |
| ACC抗体 21923-1-AP | Proteintech | 21923-1-AP | |
| HMGCS1抗体 17643-1-AP | Proteintech | 17643-1-AP | |
| SREBP2抗体 A13049 | Proteintech | A13049 | |
| Gapdh抗体 GTX100118 | GeneTex | GTX100118 | |
| IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG #926-32213 | LI-COR Biosciences | #926-32213 | |
| IRDye 680LT山羊抗兔IgG #926-68021 | LI-COR Biosciences | #926-68021 | |
| 药物处理 | 胆固醇 | Sigma-ldrich | #C8667 |
| 甲基-β-环糊精 | Sigma-ldrich | #C4555 | |
| AICAR | Selleckchem | #S1802 | |
| Compound C | Selleckchem | #S7840 | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- | |
| X-tremeGENE siRNA转染试剂 | Roche | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life | -- |
| cDNA合成 | HiScript II一步法RT-PCR试剂盒 | Vazyme | -- |
| qRT-PCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| StepOne Plus系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| Odyssey® CLx成像系统 | LI-COR | -- | |
| siRNA敲低 | Opti-MEM® I减血清培养基 | Gibco | -- |
| RNA测序 | Illumina HiSeq | Illumina | -- |
| 免疫共沉淀 | Anti-FLAG® M2磁珠 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime | -- | |
| PhosStop磷酸酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| LC-MS/MS分析 | 液相色谱-质谱联用 | PTM Biolabs Inc. | -- |
| GST pull-down | His-ATIC蛋白 | Zoonbio Biotechnology | -- |
| GST-OSBPL2蛋白 | Zoonbio Biotechnology | -- | |
| AICAR测定 | AICAR ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| ROS测量 | DCFDA | Beyotime | -- |
| CellROX™ Deep Red试剂 | ThermoFisher | -- | |
| 流式分析 | BD FACSCalibur流式细胞仪 | Becton, Dickinson and Company | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 透射电镜 | JEOL-101透射电镜 | JEOL | -- |
| 线粒体膜电位测定 | JC-1探针 | Beyotime | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism v7 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | OC1细胞培养条件：DMEM+10%FBS，33°C，10% CO2；HEK293Ta细胞培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| RNA-seq分析 | RNA-seq样本量（n=3），差异基因筛选标准（q-value<0.05, fold change≥2, FDR≤0.01）。 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and data analysis; Figure 1 legend |
| Western blot检测 | 蛋白上样量10-25 μg，一抗孵育条件（4°C过夜），二抗来源。 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis |
| 胆固醇合成相关基因表达 | Srebp2核转位（前体和核形式），Hmgcr和Hmgcs1的mRNA和蛋白水平。 阅读提示：Results: Osbpl2/osbpl2b-KO inhibits AMPK activity and increases cholesterol synthesis; Figure 2 |
| AMPK功能验证 | Compound C浓度（5 nM），AICAR浓度（0.5 μM），处理时间（24 h），siRNA浓度（100 pM），质粒用量（5 ng）。 阅读提示：Results: Osbpl2-KO increases cholesterol biosynthesis by suppressing AMPK signaling pathway; Figure 3 |
| OSBPL2-ATIC互作验证 | Co-IP和GST pull-down实验步骤，ATIC截短体构建（ΔMGS, ΔAICARFT_IMPCHase, ΔCT）。 阅读提示：Materials and methods: Co-immunoprecipitation, GST pulldown; Figure 4 |
| 胆固醇含量测定 | 细胞数量（1×10^6），组织重量（0.1 g），异丙醇体积（1 ml），测定波长（500 nm）。 阅读提示：Materials and methods: Total cholesterol assay |
| ROS检测 | DCFDA或CellROX Deep Red浓度（5 μM），孵育时间，流式细胞仪型号（BD FACSCalibur）。 阅读提示：Materials and methods: ROS measurements; Figure 5 |
| 线粒体功能检测 | TEM样品制备（2%戊二醛固定，1%锇酸后固定，包埋，超薄切片70 nm），JC-1浓度（5 μg/ml），染色时间（30 min）。 阅读提示：Materials and methods: Transmission electron microscopy assay, Mitochondrial membrane potential assay; Figure 5 |