确定β-谷甾醇的安全浓度
筛选不影响细胞活力的β-谷甾醇浓度范围，为后续实验选择合适浓度。
用不同浓度β-谷甾醇（0-40 μM）处理MAC-T细胞24小时，通过CCK-8检测细胞活力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
β-谷甾醇抑制脂多糖诱导的牛乳腺上皮细胞炎症和脂肪生成紊乱
β-Sitosterol Suppresses Lipopolysaccharide-Induced Inflammation and Lipogenesis Disorder in Bovine Mammary Epithelial Cells.
实验完整度
中本研究为体外细胞实验，包含细胞活力、氧化应激、炎症因子表达、凋亡、信号通路及脂肪合成基因检测等，但缺乏动物模型或临床样本验证。
主要模型
牛乳腺上皮细胞系MAC-T
重点核对
β-谷甾醇浓度1 μM和LPS浓度1 μg/mL 处理时间24小时 MAC-T细胞培养条件：DMEM高糖培养基，10% FBS，1%青霉素-链霉素，5 μg/mL胰岛素，1 μg/mL氢化可的松 细胞分组：对照组、β-谷甾醇组、LPS组、LPS+β-谷甾醇组
摘要
β-谷甾醇是一种天然植物甾醇，已被证明在体内具有促进抗炎和抗氧化活性的作用。本研究使用β-谷甾醇来保护牛乳腺上皮细胞免受脂多糖（LPS）诱导的细胞损伤，牛乳腺上皮细胞通常作为乳腺炎症反应和脂肪生成的细胞模型进行研究。结果表明，LPS和β-谷甾醇联合处理显著降低了氧化应激和炎症，同时增加了抗凋亡蛋白的表达，并激活缺氧诱导因子-1（HIF-1α）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路以抑制凋亡并改善脂质合成相关基因的表达。我们的研究结果表明，β-谷甾醇具有缓解乳腺炎症的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- β-谷甾醇是否能够保护牛乳腺上皮细胞免受LPS诱导的细胞损伤，并改善乳脂合成？
- 核心机制
- β-谷甾醇通过减少ROS积累恢复抗氧化酶活性，抑制NF-κB通路减轻炎症，抑制Caspase/Bcl-2通路及激活HIF-1α/mTOR信号通路抑制凋亡，并改善脂肪合成相关基因表达。
- 主要证据
- 体外MAC-T细胞实验：β-谷甾醇联合LPS处理减少ROS和炎症因子（IL-1β、TNF-α、NF-κB p65），降低凋亡率及Caspase 3、Bax表达，增加Bcl-2表达，恢复HIF-1α/mTOR通路活性，并上调SCD、PSMA5、FASN、SREBP1的表达。
- 研究意义
- 研究表明β-谷甾醇可能作为抗生素的替代品用于缓解乳腺炎，但需要进一步研究其具体作用机制和生产应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测β-谷甾醇对LPS诱导的氧化应激的影响
评估β-谷甾醇是否减轻LPS诱导的氧化应激。
用1 μM β-谷甾醇和1 μg/mL LPS处理MAC-T细胞24小时，检测CAT、GSH、T-AOC、T-SOD活性和ROS水平。
检测β-谷甾醇对LPS诱导的炎症因子的影响
评估β-谷甾醇是否抑制LPS诱导的炎症反应。
用1 μM β-谷甾醇和1 μg/mL LPS处理MAC-T细胞24小时，通过RT-qPCR和Western blot检测IL-1β、TNF-α和NF-κB p65的表达。
检测β-谷甾醇对LPS诱导的细胞凋亡的影响
评估β-谷甾醇是否抑制LPS诱导的细胞凋亡。
用1 μM β-谷甾醇和1 μg/mL LPS处理MAC-T细胞24小时，通过流式细胞术检测凋亡率，并通过RT-qPCR和Western blot检测Caspase 3、Bax、Bcl-2的表达。
检测β-谷甾醇对HIF-1α/mTOR信号通路的影响
探究β-谷甾醇是否通过调节HIF-1α/mTOR信号通路发挥作用。
用1 μM β-谷甾醇和1 μg/mL LPS处理MAC-T细胞24小时，通过RT-qPCR和Western blot检测HIF-1α、mTOR及p-mTOR的表达。
检测β-谷甾醇对脂肪合成相关基因的影响
评估β-谷甾醇是否改善LPS抑制的脂肪合成。
用1 μM β-谷甾醇和1 μg/mL LPS处理MAC-T细胞24小时，通过RT-qPCR和Western blot检测SCD、PSMA5、LPL、FASN、SREBP1的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | β-谷甾醇 | Yuan Ye Bio-Technology Co., Ltd. | S24012 |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Meilunbio | -- |
| 氧化应激检测 | CAT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| GSH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| T-AOC检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| T-SOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Meilun Biologicals | -- | |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Meilunbio | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Meron Bio | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | -- |
| RT-qPCR | HiFi Script cDNA合成试剂盒 | CWBIO | -- |
| UltraSYBR预混液 | CWBIO | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| ECL化学发光底物 | Meilunbio | -- | |
| 仪器设备 | 酶标仪 | BioTek Instruments | Eon |
| ROS检测 | BioTek CYTATION 5成像仪 | BioTek | -- |
| 凋亡检测 | CytoFLEX BA32233流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| RNA浓度检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| RT-qPCR | ECO Gene扩增仪 | BIOER | -- |
| Western blot | 兔抗β-actin多克隆抗体 | Bioss | bs-0061R |
| 兔抗NF-κB (p65)多克隆抗体 | Bioworld | BSP4135 | |
| 兔抗Caspase 3多克隆抗体 | Bioss | bs-0081R | |
| 兔抗Bax多克隆抗体 | Bioss | bs-0127R | |
| 兔抗Bcl-2多克隆抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 兔抗HIF-1α多克隆抗体 | Bioss | bs-0737R | |
| 兔抗mTOR多克隆抗体 | Proteintech | 28273-1-AP | |
| 兔抗磷酸化mTOR多克隆抗体 | Proteintech | 67778-1-lg | |
| 兔抗SCD多克隆抗体 | Bioss | bs-3787R | |
| 小鼠抗PSMA5多克隆抗体 | Bioss | bsm-51520M | |
| 兔抗LPL多克隆抗体 | Bioss | bs-1973R | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | Bioss | bs-40295G-HRO | |
| 山羊抗小鼠IgG抗体 | Bioss | bs-40296G-HRP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | MAC-T细胞系来源、代数、培养条件（DMEM高糖、10% FBS、1%青霉素-链霉素、5 μg/mL胰岛素、1 μg/mL氢化可的松，37°C，5% CO2） 阅读提示：见Materials and Methods第4.1节Cell Culture |
| 药物处理 | β-谷甾醇浓度1 μM、LPS浓度1 μg/mL、处理时间24小时、分组（对照组、β-谷甾醇组、LPS组、LPS+β-谷甾醇组） 阅读提示：见Materials and Methods第4.2节Cell Treatment |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒使用、细胞密度5×10^3/孔、处理24小时、加入CCK-8 10 μL/孔孵育2小时、450 nm读取吸光度 阅读提示：见Materials and Methods第4.3节Cell Viability Assay |
| 氧化应激检测 | CAT、GSH、T-AOC、T-SOD试剂盒（南京建成）、ROS检测使用DCFH-DA（10 μg/mL）、处理条件同药物处理 阅读提示：见Materials and Methods第4.4节和4.5节 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI染色、流式细胞仪检测至少10^4个细胞 阅读提示：见Materials and Methods第4.6节Cell Apoptosis Assay |