检测CDR1as在胆管癌细胞系中的表达
明确CDR1as在胆管癌细胞中的表达水平，为其在CCA中的作用研究提供基础。
通过RT-qPCR检测胆管上皮细胞系HIBEpiC和两种人CCA细胞系HCCC-9810、RBE中CDR1as的表达水平。
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环状RNA CDR1as通过部分调控MicroRNA 641在胆管癌中发挥致癌特性
Circular RNA CDR1as Exerts Oncogenic Properties Partially through Regulating MicroRNA 641 in Cholangiocarcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、双荧光素酶报告、RIP、pulldown、放线菌素D稳定性实验及体内异种移植瘤模型等多层级验证。
主要模型
人胆管癌细胞系HCCC-9810和RBE 胆管上皮细胞系HIBEpiC BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型
重点核对
CDR1as在人胆管癌细胞系HCCC-9810和RBE中的表达水平 CDR1as过表达或敲低对细胞增殖、迁移、侵袭的影响 miR-641 mimics或抑制剂对CDR1as效应的逆转作用 CDR1as与miR-641、miR-641与AKT3/mTOR 3'UTR的直接结合及作用位点 体内异种移植瘤模型中CDR1as对肿瘤生长的影响及miR-641 agomir/antagomir的调节作用
摘要
已发现环状RNA（circRNA）CDR1as在胆管癌（CCA）组织中表达上调。在本研究中，我们试图探讨CDR1as在CCA中的作用。在人CCA细胞中过表达或敲低CDR1as，以评估CDR1as对细胞行为和肿瘤异种移植生长的影响。在体外，CCA细胞系中CDR1as水平显著升高。结果表明，CDR1as促进CCA细胞的增殖、迁移、侵袭以及AKT3/mTOR通路的激活。此外，miR-641是CDR1as的预测靶标microRNA（miRNA），可部分逆转CDR1as对CCA细胞行为的影响。进一步地，CDR1as促进肿瘤异种移植生长，而这种作用在体内可被miR-641减弱。此外，在CCA细胞中CDR1as的表达与miR-641呈负相关，且miR-641可直接与CDR1as及其靶基因AKT3和mTOR结合。机制上，CDR1as可与miR-641结合并加速miR-641的降解，这可能导致RBE细胞中AKT3和mTOR相对mRNA水平的上调。总之，我们的研究结果表明，CDR1as可能通过调控miR-641在CCA中发挥致癌特性（至少部分如此）。CDR1as和miR-641可被视为CCA的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在胆管癌（CCA）中，环状RNA CDR1as是否具有致癌作用，并探讨其具体机制，特别是其是否通过调控miR-641来发挥作用。
- 核心机制
- CDR1as作为miR-641的分子海绵，直接结合并加速miR-641的降解，从而解除miR-641对其靶基因AKT3和mTOR的抑制作用，导致AKT3和mTOR表达上调，进而激活AKT3/mTOR信号通路，促进CCA细胞的增殖、迁移和侵袭。
- 主要证据
- 体外实验显示CDR1as在CCA细胞系中高表达，过表达CDR1as促进细胞增殖、迁移和侵袭，敲低则相反；双荧光素酶报告基因实验证实miR-641与CDR1as、AKT3和mTOR的3'UTR直接结合；RIP和pulldown实验证实CDR1as与miR-641的直接结合；放线菌素D实验表明CDR1as加速miR-641降解并增加AKT3和mTOR mRNA的稳定性；体内裸鼠移植瘤实验证实CDR1as促进肿瘤生长，且miR-641可部分逆转此效应。
- 研究意义
- 研究揭示CDR1as在CCA中通过调控miR-641/AKT3/mTOR轴发挥致癌作用，提示CDR1as和miR-641可作为CCA的预后生物标志物，且CDR1as/miR-641轴可能成为CCA新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能获得与缺失实验
评估CDR1as对胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在HCCC-9810和RBE细胞中过表达或敲低CDR1as，通过CCK-8、克隆形成、划痕和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。
检测CDR1as对AKT3/mTOR信号通路的影响
探究CDR1as是否影响AKT3/mTOR信号通路的激活。
在CDR1as过表达或敲低的细胞中，通过RT-qPCR检测AKT3和mTOR的mRNA水平，通过Western blot检测AKT3、mTOR、p70S6K、4EBP1及其磷酸化蛋白水平。
验证CDR1as与miR-641的靶向关系
验证miR-641是否为CDR1as的靶miRNA，并确认二者的直接结合。
通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-641与CDR1as的结合；RT-qPCR检测miR-641在CDR1as过表达或敲低后的表达变化；RIP实验检测AGO2富集；RNA pulldown实验检测CDR1as与miR-641的直接结合。
验证miR-641对CDR1as细胞功能的逆转作用
探究miR-641是否能逆转CDR1as对胆管癌细胞行为的影响。
在HCCC-9810或RBE细胞中共转染CDR1as-OV与miR-641 mimics，或CDR1as-sh2与miR-641抑制剂，通过CCK-8检测细胞增殖，划痕实验检测迁移，Transwell检测侵袭，Western blot检测AKT3/mTOR通路蛋白表达。
验证AKT3和mTOR为miR-641的直接靶基因
确认miR-641是否直接靶向AKT3和mTOR基因。
通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-641与AKT3和mTOR 3'UTR的结合；pulldown实验验证miR-641与AKT3 mRNA的直接结合；通过AKT3 siRNA敲低实验，探究miR-641对细胞功能的影响是否依赖于AKT3。
探究CDR1as/miR-641对RNA稳定性的影响
阐明CDR1as如何通过miR-641调控AKT3和mTOR的RNA稳定性。
在RBE细胞中转染CDR1as-OV、CDR1as-sh2或miR-641 mimics，并用放线菌素D（Act D）阻断新转录，检测CDR1as、miR-641、AKT3和mTOR的RNA剩余水平随时间的变化。
体内裸鼠异种移植瘤实验
评估CDR1as在体内对胆管癌肿瘤生长的影响，以及miR-641的调节作用。
将稳定转染CDR1as-OV、NC1、CDR1as-sh2或NC2的RBE细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，待成瘤后每3天尾静脉注射miR-641 agomir/antagomir或对照，定期测量肿瘤体积，第28天处死，通过免疫组化和Western blot检测AKT3和p-AKT3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 内皮细胞培养基 | Zhongqiaoxinzhou | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| G418遗传霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖活性检测试剂盒 | KeyGen Biotech | KGA317 |
| 酶标仪 | BioTek | -- | |
| 克隆形成 | 瑞氏-吉姆萨染色试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D010 |
| 显微镜 (IX53) | Olympus | -- | |
| 成像系统 (DP73) | Olympus | -- | |
| Transwell侵袭实验 | Matrigel侵袭小室 | Corning | 3422 |
| 结晶紫 | Amresco | 0528 | |
| RNA提取与RT-qPCR | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | Tiangen | DP419 |
| RNA酶抑制剂 | Tiangen | DP418 | |
| RT-qPCR | TIANSeq莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 | Tiangen | NG212 |
| SYBR荧光染料 | Solarbio | SY1020 | |
| 2×Taq PCR预混液 | Tiangen | KT201 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| PDVF膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂奶粉 | Sangon Biotech | A600669 | |
| 牛血清白蛋白 | Biosharp | BS043 | |
| 抗磷酸化AKT3抗体 | Abcam | ab192623 | |
| 抗AKT3抗体 | CST | 14982 | |
| 抗磷酸化mTOR抗体 | CST | 5536 | |
| 抗mTOR抗体 | CST | 2972 | |
| 抗磷酸化p70S6K抗体 | CST | 9234 | |
| 抗p70S6K抗体 | CST | 9202 | |
| 抗磷酸化4EBP1抗体 | CST | 2855 | |
| 抗4EBP1抗体 | CST | 9644 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Solarbio | -- | |
| ECL化学发光液 | Solarbio | PE0010 | |
| RNA免疫沉淀 | EZ-Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Merck Millipore | 17-701 |
| 抗AGO2抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗IgG抗体 | Wanleibio | -- | |
| RNA pull-down | Pierce磁珠RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20164 |
| Thermo Scientific Pierce RNA 3'脱硫生物素化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TRIpure试剂 | BioTeke | RP1001 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | KeyGen Biotech | KGAF040 |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | HFK Bioscience | -- |
| 免疫组化 | 3%过氧化氢溶液 | Sinopharm | -- |
| 山羊血清 | Solarbio | -- | |
| AKT3一抗 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 磷酸化AKT3一抗 | Bioss | Bs-15963R | |
| 二抗 | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| DAB显色液 | Solarbio | DA1010 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源及培养条件（HIBEpiC、HCCC-9810、RBE；ECM、RPMI 1640+10% FBS）；转染试剂（Lipofectamine 2000）；稳定筛选G418浓度（HCCC-9810 300μg/ml，RBE 400μg/ml） 阅读提示：Materials and Methods 中 'Cell culture and transfection' 部分 |
| CDR1as表达检测 | RT-qPCR方法、内参（U6、GAPDH）及引物序列 阅读提示：Materials and Methods 中 'RNA extraction and real-time quantitative PCR' 部分及Table 2 |
| 细胞增殖、迁移与侵袭实验 | CCK-8检测时间点（0、24、48、72小时等）、细胞接种密度（5×10^3/孔）；克隆形成细胞密度（1×10^3/孔）及培养时长（约2周）；划痕实验细胞处理（1μg/ml丝裂霉素C）、划痕及成像时间（0和24h）；Transwell细胞密度（1×10^4）及培养时间（24h） 阅读提示：Materials and Methods 中 'Cell Counting Kit-8 assay', 'Colony formation assay', 'Wound-healing assay', 'Transwell assay' 部分及对应的Figure legends |
| AKT3/mTOR通路蛋白检测 | Western blot所用抗体（anti-p-AKT3、anti-AKT3、anti-p-mTOR、anti-mTOR、anti-p-p70S6K、anti-p70S6K、anti-p-4EBP1、anti-4EBP1、anti-GAPDH）及稀释比例（未明确说明） 阅读提示：Materials and Methods 中 'Western blot analysis' 部分 |
| miR-641靶向验证 | 双荧光素酶报告基因实验中，CDR1as、AKT3、mTOR的野生型与突变型序列构建；RIP实验中AGO2抗体用量（5μg）；pulldown实验中生物素标记探针序列 阅读提示：Materials and Methods 中 'RNA binding protein immunoprecipitation'、'Biotinylated RNA pulldown assay'、'Dual-luciferase reporter assay' 部分及Table 1 |
| RNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（20μg/ml）及作用时间（0、4、8、24小时） 阅读提示：Materials and Methods 中 'Actinomycin D assay' 部分及Figure 9 legend |
| 体内异种移植瘤实验 | 小鼠品系及周龄（BALB/c裸鼠，6周龄，18-20g）；分组及每组数量（8组，6只/组）；细胞注射量（5×10^6个/100μl）；尾静脉注射miR-641 agomir/antagomir的频率（每3天一次）；肿瘤测量时间（第7天至第28天，每3天测量一次）；处死时间（第28天） 阅读提示：Materials and Methods 中 'Xenograft mouse model' 部分及Figure 10 legend |