患者CD4+ T细胞中TIGIT表达分析
比较PM患者与健康对照中TIGIT及相关受体表达，探讨TIGIT缺陷是否与疾病相关
从PM、DM、SLE及健康对照中分离PBMC，通过流式细胞术检测CD4+ T细胞中TIGIT、CD226、CD96表达，并在抗CD3/CD28刺激前后比较。
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TIGIT缺陷通过代谢-表观遗传机制促进自身免疫性肌炎中的自身反应性CD4+ T细胞反应
TIGIT deficiency promotes autoreactive CD4+ T-cell responses through a metabolic‒epigenetic mechanism in autoimmune myositis.
实验完整度
高包含患者样本、Tigit敲除小鼠、体外T细胞分化、代谢组学、表观遗传学及体内回补实验等多层级验证。
主要模型
多发性肌炎患者外周血CD4+ T细胞 Tigit−/−小鼠 实验性自身免疫性肌炎（EAM）模型 NCG人源化小鼠模型
重点核对
PM患者与健康对照的CD4+ T细胞中TIGIT表达差异 Tigit−/−小鼠与野生型小鼠在EAM诱导后Th1/Th17细胞比例及肌肉炎症严重程度 CD155-Fc（10 μg/ml）刺激对CD4+ T细胞细胞因子产生的影响 UK5099（20 μM）抑制线粒体丙酮酸载体对乙酰辅酶A和组蛋白乙酰化的影响 C646（10 mg/kg/d）体内给药对EAM小鼠疾病严重程度的影响
摘要
多发性肌炎（PM）是一种以肌肉炎症浸润和变性为特征的系统性自身免疫性疾病。含Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）通过抑制T细胞介导的自身免疫来促进免疫耐受。在此，我们表明，PM患者CD4+ T细胞中TIGIT表达降低促进这些细胞分化为Th1和Th17细胞，这可以通过TIGIT过表达得到挽救。在实验性自身免疫性肌炎小鼠模型中，敲除TIGIT会增强肌肉炎症。机制上，我们发现TIGIT缺陷增强了CD28介导的PI3K/AKT/mTOR共刺激通路，该通路促进葡萄糖氧化、柠檬酸产生和胞质乙酰辅酶A水平升高，最终通过组蛋白乙酰化诱导表观遗传重编程。重要的是，药理学抑制组蛋白乙酰化可抑制Th1和Th17细胞的分化，减轻肌肉炎症。因此，我们的发现揭示了TIGIT通过代谢-表观遗传重编程直接影响Th1和Th17 T细胞分化的机制，对治疗系统性自身免疫性疾病具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TIGIT缺陷如何促进自身免疫性肌炎中自身反应性CD4+ T细胞反应？
- 核心机制
- TIGIT缺陷增强CD28介导的PI3K/AKT/mTOR信号，促进葡萄糖氧化和柠檬酸产生，增加胞质乙酰辅酶A水平，导致组蛋白乙酰化增加，从而促进Th1和Th17细胞分化。
- 主要证据
- PM患者TIGIT表达降低与Th1/Th17细胞频率增加相关；Tigit敲除小鼠在EAM中表现出增强的Th1/Th17反应和肌肉炎症；TIGIT过表达或CD155-Fc刺激可抑制细胞因子产生；代谢抑制和组蛋白乙酰化抑制剂可逆转效应。
- 研究意义
- 揭示TIGIT作为代谢-表观遗传检查点在控制自身反应性CD4+ T细胞反应中的作用，为治疗T细胞介导的自身免疫性疾病提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TIGIT过表达和CD155-Fc刺激实验
验证TIGIT功能丧失是否导致促炎细胞因子产生增加，以及恢复TIGIT能否逆转
对PM和HC的CD4+ T细胞进行TIGIT过表达或CD155-Fc刺激，检测IFNγ和IL-17A产生。
TIGIT敲低或敲除对T细胞分化的影响
确定TIGIT缺失是否促进Th1和Th17细胞分化
使用siRNA敲低人CD4+ T细胞中TIGIT，或使用Tigit−/−小鼠的初始CD4+ T细胞，在Th1、Th2、Th17和Treg极化条件下培养，检测转录因子和细胞因子表达。
体内EAM模型验证
评估TIGIT缺失对自身免疫性肌炎发展的影响
对Tigit−/−、Tigit+/−和Tigit+/+小鼠诱导EAM，评估肌肉力量、脾脏指数、CD4+ T细胞细胞因子产生和肌肉组织学变化。
代谢表型分析
探究TIGIT缺陷是否改变CD4+ T细胞的葡萄糖代谢
通过2-NBDG葡萄糖摄取、Seahorse分析、13C-葡萄糖稳定同位素示踪检测代谢变化。
表观遗传机制研究
验证TIGIT介导的代谢改变是否通过组蛋白乙酰化影响基因表达
检测CD4+ T细胞中ACLY表达、胞质和线粒体乙酰辅酶A水平、H3K9和H3K27乙酰化，并通过ChIP-qPCR分析特定基因启动子的乙酰化变化。
信号通路分析
确定TIGIT抑制T细胞的具体信号机制
比较Tigit−/−和Tigit+/+ CD4+ T细胞中CD226、TCR信号（ZAP70、LCK）和CD28下游PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | EasySep™ 分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17952 |
| EasySep™ 分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17555 | |
| 磁珠 | STEMCELL Technologies | 19852 | |
| 磁珠 | STEMCELL Technologies | 19765 | |
| 细胞培养 | advanced RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12633012 |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| L-谷氨酰胺 | MCE | HY-N0390 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| T细胞激活 | 抗CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11132D |
| 抗CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11453D | |
| T细胞分化 | 抗IL-4抗体 | BioLegend | 500838 |
| IL-12 | Sino Biological | CT011-H08H | |
| IL-2 | PeproTech | 200-02-10 | |
| 抗IFNγ抗体 | BioLegend | 506532 | |
| IL-4 | PeproTech | 200-02-20 | |
| TGFβ1 | PeproTech | 100-21-2 | |
| IL-6 | PeproTech | 200-06-5 | |
| IL-23 | PeproTech | 200-23-2 | |
| 抗IL-4抗体 | BioLegend | 504102 | |
| IL-12 | PeproTech | 210-12-2 | |
| IL-2 | Sino Biological | 51061-MNAE | |
| 抗IFNγ抗体 | BioLegend | 505702 | |
| IL-4 | Sino Biological | 51084-MNAE | |
| TGFβ1 | Sino Biological | 80116-RNAH-5 | |
| IL-6 | Sino Biological | 50136-MNAE | |
| IL-23 | NovoProtein | C03U | |
| IL-1β | Sino Biological | 50101-MNAE | |
| 药物处理 | UK5099 | MCE | HY-15475 |
| MSDC-0206 | MCE | HY-108022 | |
| 依托莫昔 | MCE | HY-50202 | |
| BPTES | MCE | HY-12683 | |
| PI-103 | MCE | HY-10115 | |
| C646 | Selleck | S7152 | |
| BEZ235 | Selleck | S1009 | |
| TIGIT刺激 | CD155-Fc嵌合蛋白 | Sino Biological | 10109-H02H |
| IgG1 | Sigma | I5154 | |
| T细胞增殖 | CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 |
| 转染 | P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L | Lonza | V4XP-3024 |
| TIGIT敲低 | TIGIT siRNA | Sangon | H540013-0001 |
| 流式细胞术 | PMA | Sigma | P8139 |
| 离子霉素 | Sigma | I0634 | |
| 布雷菲德菌素A | Sigma | B7651 | |
| 固定/透化液 | BD Biosciences | 554722 | |
| FoxP3染色试剂盒 | eBioscience | 554714 | |
| Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒 | MultiSciences | 70-AP101 | |
| Zombie Red | Biolegend | 423110 | |
| LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 线粒体染色 | MitoTracker Green | Invitrogen | M7514 |
| MitoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | EpiZyme | ZJ101 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| Chemilucent™ Plus Western Blot增强试剂盒 | Millipore | -- | |
| 钙通量检测 | Fluo-3 AM | Solarbio | F8840 |
| 抗CD3-生物素抗体 | Biolegend | 100303 | |
| 链霉亲和素 | Sigma | S4762 | |
| 葡萄糖摄取 | 2-NBDG | Thermo Fisher Scientific | N13195 |
| 脂质摄取 | Bodipy500/510 | Thermo Fisher Scientific | D3793 |
| 脂质含量 | Bodipy 493/503 | Thermo Fisher Scientific | D3922 |
| 代谢分析 | 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 |
| 糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | 103020-100 | |
| Seahorse XF96分析仪 | Agilent | -- | |
| Cell-Tak细胞粘附剂 | Corning | 354240 | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | -- | -- | |
| 葡萄糖 | -- | -- | |
| 代谢组学 | 13C6标记葡萄糖 | MCE | HY-B0389A |
| Thermo 1310气相色谱系统 | Thermo | -- | |
| ISQ QD质谱仪 | Thermo | -- | |
| Trace Finder 3.2软件 | -- | -- | |
| INCA软件 | -- | -- | |
| 超高效液相色谱-三重四极杆质谱 | Waters | -- | |
| MassLynx软件 | Waters | v4.1 | |
| 乙酰辅酶A检测 | 乙酰辅酶A检测试剂盒 | Solarbio | BC0980 |
| 分光光度计 | Shimadzu | -- | |
| 质粒构建 | 2× Phanta Flash Master Mix | Vazyme Biotech | P510-01 |
| BamHI限制酶 | TransGen Biotech | JB101-01 | |
| EcoRI限制酶 | TransGen Biotech | JE201-01 | |
| MultiS一步克隆试剂盒 | Vazyme Biotech | C113-01 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 逆转录试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11706 | |
| SYBR Green | Accurate Biotechnology | AG11718 | |
| ChIP-qPCR | 甲醛 | Macklin | F809702 |
| ChIP分析试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P2078 | |
| 抗H3K9ac抗体 | Cell Signaling Technology | 9649 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Cell Signaling Technology | 8173 | |
| 对照IgG | Millipore | 12-370 | |
| DNA纯化试剂盒 | Beyotime Biotechnology | D0033 | |
| RNA-seq | BGIseq500测序平台 | BGI | -- |
| 小鼠实验 | 百日咳毒素 | MCE | HY-112779 |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma | F5881 | |
| 肌球蛋白 | -- | -- | |
| 抗TIGIT抗体 | BioXcell | BE0274 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | BioXcell | BE0083 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本 | PM患者诊断标准（2017 EULAR/ACR）、疾病活动度（MYOACT）、血清肌酸激酶水平、样本量 阅读提示：Methods: Patients |
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、EAM诱导方案（肌球蛋白剂量、佐剂、免疫次数、时间间隔）、TIGIT激动剂抗体（10 mg/kg/Q3d）或C646（10 mg/kg/d）给药方案 阅读提示：Methods: Mice, Mouse experiments |
| T细胞分选与培养 | CD4+ T细胞分选方法（阴性选择）、纯度、培养基成分、抗CD3/CD28磁珠比例、极化条件（细胞因子浓度）、培养时间 阅读提示：Methods: Cell isolation, T-cell cultures, T-cell activation and differentiation |
| 代谢分析 | Seahorse检测细胞数、药物处理浓度和时间（如UK5099 20 μM）、13C-葡萄糖标记时间和浓度 阅读提示：Methods: Seahorse assay, Stable isotope labeling and metabolomics |
| 表观遗传分析 | ChIP-qPCR的细胞处理、抗体（H3K9ac, H3K27ac）、引物序列、乙酰辅酶A检测方法 阅读提示：Methods: ChIP–qPCR, Detection of subcellular acetyl-CoA |