Co-Inhibition of tGLI1 and GP130 Using FDA-Approved Ketoconazole and Bazedoxifene Is Synergistic Against the Growth and Metastasis of HER2-Enriched and Triple-Negative Breast Cancers.
包含体外细胞实验（过表达、药物处理、CSC表型检测）、体内PDX模型及心内注射转移模型，并进行了机制验证（凋亡、AR独立性、下游靶标）和临床样本分析（TMA、患者数据集）。
HER2富集型乳腺癌细胞系SKBRM、SKBR3 三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT20、SUM-159、MDA-MB-468 TNBC患者来源异种移植模型PDX-3887 MDA-MB-231-tGLI1 TNBC心内注射转移模型
tGLI1与GP130共过表达促进乳腺癌干细胞表型（哺乳球形成、CD44+/CD24−、ALDH活性） KCZ和BZA联合在体外对乳腺癌细胞增殖和CSC表型具有协同作用（CI<1） KCZ+BZA联合在体内抑制TNBC PDX肿瘤生长并诱导凋亡（Ki-67降低，cleaved PARP增加） KCZ+BZA联合在体内减少TNBC心内注射模型的转移负担并延长总生存期 tGLI1与IL-6/IL-6R/GP130共激活与TNBC患者较短的无转移生存期相关
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证tGLI1、GP130和pSTAT3在正常乳腺细胞和不同亚型乳腺癌细胞中的表达，以及临床样本中的共表达和共激活情况。
利用Western blot检测正常乳腺细胞系和乳腺癌细胞系中tGLI1、GP130、pSTAT3和STAT3的蛋白表达；利用IHC检测49例淋巴结阳性原发乳腺癌组织芯片中tGLI1和GP130的表达；利用TCGA和GEO数据集的GSEA和激活评分分析tGLI1+IL-6/IL-6R/GP130信号通路的共激活。
探究tGLI1和GP130共过表达是否能促进HER2富集型和TNBC细胞系的乳腺癌干细胞表型。
在SKBR3和BT20细胞中瞬时共转染tGLI1和GP130，通过RT-qPCR和Western blot验证过表达，然后进行哺乳球形成实验、RT-qPCR和Western blot检测干性标记物（OCT4、Nanog、SOX2）、流式细胞术检测CD44+/CD24−细胞比例，以及ALDH活性实验。
探讨KCZ和BZA联合是否能协同抑制HER2富集型和TNBC细胞的增殖和乳腺癌干细胞表型。
使用SKBRM、MDA-MB-231及其tGLI1过表达细胞，通过哺乳球形成实验计算CI，通过RT-qPCR和Western blot检测干性标记物，通过流式细胞术检测CD44+/CD24−细胞，通过ALDH活性实验，通过细胞活性实验和划痕实验检测迁移。
评估KCZ和BZA联合在体内对TNBC肿瘤生长的抑制作用及毒性。
使用TNBC PDX-3887模型，将肿瘤组织接种于雌性裸鼠乳腺脂肪垫，待肿瘤达50-100 mm³后随机分组，腹腔注射给药，监测肿瘤体积和体重，终点时取肿瘤进行IHC分析（Ki-67，cleaved PARP），并检测血清ALT活性。
评估KCZ和BZA联合是否能减少TNBC的转移负担并延长生存期。
使用心内注射模型，将表达荧光素酶的MDA-MB-231-tGLI1细胞注射入雌性裸鼠左心室，通过生物发光成像监测转移负担，记录无转移生存期和总生存期，并监测体重和血清ALT活性。
评估tGLI1和IL-6/IL-6R/GP130的共激活与乳腺癌患者（尤其是TNBC）无转移生存期的关系。
利用公开的GEO乳腺癌患者数据集，通过Kaplan-Meier分析和log-rank检验，比较根据tGAS和IL-6/IL-6R/GP130激活评分高低的患者群的MFS。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 35-10-CV |
| 胎牛血清 | Corning | 35-10-CV | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| BM-Cyclin | Sigma-Aldrich | 10-799-050-001 | |
| 药物处理 | 酮康唑 | Cayman Chemical | 1512 |
| 巴多昔芬醋酸盐 | AdooQ Bioscience | A11665 | |
| Western blot | GLI1抗体 | Cell Signaling Technology | 2643 |
| tGLI1特异性抗体 | YenZym | -- | |
| GP130抗体 | Cell Signaling Technology | 3732 | |
| pSTAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9131L | |
| STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| OCT4抗体 | Cell Signaling Technology | 2750 | |
| Nanog抗体 | Cell Signaling Technology | 4903 | |
| SOX2抗体 | Cell Signaling Technology | 4900 | |
| Cyclin D1抗体 | Cell Signaling Technology | 2922 | |
| Bcl2抗体 | Cell Signaling Technology | 4223 | |
| BclXL抗体 | Cell Signaling Technology | 2764 | |
| Cep70抗体 | Proteintech | 16280-1-AP | |
| UPF3A抗体 | Proteintech | 17114-1-AP | |
| RRas2抗体 | Proteintech | 12530-1-AP | |
| PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9532 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6074 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| 划痕实验 | KEYENCE细胞成像系统 | KEYENCE | -- |
| ImageJ | -- | -- | |
| 动物实验 | 裸鼠 | Charles River | -- |
| 聚乙二醇300 | Sigma-Aldrich | 202371 | |
| 吐温20 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| D-荧光素 | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Lumina LT系列III成像仪 | Perkin Elmer | -- | |
| Living Image软件 | Perkin Elmer | 4.7.2 | |
| ALT检测 | ALT检测试剂盒 | Cayman Chemical | 700260 |
| RT-qPCR | QIAGEN RNeasy试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| IHC/TMA | 乳腺癌组织微阵列 | US Biomax | BR10010f |
| GP130抗体 | Abcam | ab202850 | |
| Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9027 | |
| Cleaved PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| 流式细胞术 | X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Millipore Sigma | 6366236001 |
| LIVE/DEAD固定死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L23105 | |
| CD44抗体 | BioLegend | 103012 | |
| CD24抗体 | eBioscience | 11024742 | |
| APC大鼠IgG2b同型对照 | Biolegend | 400612 | |
| FITC小鼠IgG1 κ同型对照 | eBiosceince | 11471482 | |
| Annexin V/PI染色试剂盒 | Abcam | ab39758 | |
| BD LSRFortessa细胞分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | V10.10.0 | |
| 哺乳球形成 | 超低吸附24孔板 | Corning | 3473 |
| ALDH活性 | ALDH活性检测试剂盒 | Abcam | ab155893 |
| 酶标仪 | Agilent Biotek | Synergy H1 | |
| siRNA敲低 | AR siRNA | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养 | 细胞系来源（ATCC、WFSM、其他实验室）、培养基（DMEM含10% FBS和1% P/S）、培养条件 阅读提示：Materials and Methods, 2.1 Cell Lines and Reagents |
| 药物处理 | KCZ和BZA的浓度、比例（5:1, 10:1, 20:1）、溶剂（DMSO）、处理时间（24-72小时） 阅读提示：Materials and Methods, 2.3 Cell Viability Assay and Combination Index (CI) Analyses; 2.5 Scratch-Wound Assay; Results 3.3, 3.4 |
| 体外CSC表型检测 | 哺乳球形成条件（低附着板、细胞密度、培养时间）、CD44/CD24染色条件、ALDH活性检测条件 阅读提示：Materials and Methods, 2.10 Flow Cytometry; 2.11 Mammosphere Assay; 2.12 ALDH Activity Assay |
| 体内PDX模型 | PDX-3887来源、接种位置（乳腺脂肪垫）、肿瘤起始体积（50-100 mm³）、给药剂量（KCZ 50 mg/kg, BZA 20 mg/kg）、给药频率（每日一次，每周5天）、给药途径（腹腔注射） 阅读提示：Materials and Methods, 2.6 Animal Studies; Results 3.6 |
| 体内转移模型 | 细胞系（MDA-MB-231-tGLI1）、接种数量（1.0×10^5）、接种途径（心内注射）、给药剂量（KCZ 50 mg/kg, BZA 10 mg/kg）、给药开始时间（接种后3天） 阅读提示：Materials and Methods, 2.6 Animal Studies; Results 3.7 |
| 临床数据分析 | 数据集（TCGA、GEO）、tGAS和IL-6/IL-6R/GP130激活评分的定义、分组标准（高vs低） 阅读提示：Materials and Methods, 2.2 MFS, GSEA, and Statistical Analysis; Results 3.1, 3.8 |
