体外表达验证
评估S6P突变的刺突蛋白在细胞中的表达水平及与ACE2的结合能力。
将编码不同刺突蛋白的mRNA转染HEK293T细胞，通过Western blot和流式细胞术检测表达与结合。
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Delta和Omicron变异株刺突蛋白中的S6P突变显著增强mRNA COVID-19疫苗的功效
S6P mutation in Delta and Omicron variant spike protein significantly enhances the efficacy of mRNA COVID-19 vaccines.
实验完整度
高实验包含体外细胞转染、小鼠免疫、活病毒攻毒、假病毒中和等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 Balb/c小鼠 K18-hACE2转基因小鼠
重点核对
RV-1730剂量：1、2.5、5、10、20 μg/只 免疫程序：初免在第0天，加强在第21天（或14天） 攻毒剂量：WT 5.5 x 10^4 PFU/只，Delta 1.5 x 10^4 PFU/只 对照组：PBS或WT S2P mRNA疫苗 中和抗体检测：假病毒中和试验和PRNT
摘要
背景：SARS-CoV-2变异株的不断出现对现有COVID-19疫苗的有效性构成重大挑战。增强刺突蛋白的稳定性和免疫原性对于提高疫苗性能和应对变异株驱动的免疫逃逸至关重要。方法：我们开发了一种基于mRNA的疫苗RV-1730，编码带有S6P突变的Delta变异株刺突蛋白，以增强稳定性和免疫原性。疫苗的免疫原性和保护效力在临床前模型中进行了评估，包括单价（RV-1730）和二价（RV-1731）制剂，分别靶向Delta和BA.1变异株。此外，还评估了RV-1730在BNT162b2（辉瑞-BioNTech）和mRNA-1273（Moderna-NIAID）初次免疫后作为异源加强剂的效力。结果：与基于S2P的疫苗相比，RV-1730诱导显著更强的B细胞和T细胞反应及更持久的中和抗体。二价RV-1731疫苗对包括XBB1.5和JN.1在内的新出现变异株显示出广泛的中和活性。重要的是，RV-1730在BNT162b2或mRNA-1273初次免疫后用作异源加强剂时，显著增强了对多种变异株（包括Delta和Omicron）的中和抗体滴度。RV-1730和RV-1731均在临床前模型中提供了优越的保护效果，表明S6P突变增强了疫苗效力。结论：将S6P突变引入Delta变异株刺突蛋白显著增强了基于mRNA的COVID-19疫苗的免疫原性和效力。RV-1730作为异源加强剂的强劲表现以及二价RV-1731疫苗的广谱活性凸显了它们作为针对SARS-CoV-2及其不断演变变异株的多功能且有效的疫苗接种策略的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究在Delta变异株刺突蛋白中引入S6P突变能否增强mRNA COVID-19疫苗的免疫原性和保护效力，并评估其作为异源加强剂的潜力。
- 核心机制
- S6P突变通过额外引入四个脯氨酸取代（F817P, A892P, A899P, A942P）增强刺突蛋白的预融合稳定性和表达水平，从而提升免疫原性。
- 主要证据
- RV-1730在HEK293T细胞中表达水平高于S2P疫苗，在小鼠模型中诱导更强的B/T细胞反应、中和抗体和完全保护作用；RV-1731对XBB1.5和JN.1假病毒具有中和活性。
- 研究意义
- S6P突变的加入显著增强了mRNA疫苗的免疫原性和效力，RV-1730和RV-1731作为下一代疫苗候选和加强策略具有潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫原性评估
检测RV-1730在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。
Balb/c小鼠肌肉注射不同剂量RV-1730，两次免疫间隔21天，采集血清和脾脏进行ELISA、中和抗体、ELISpot和细胞因子检测。
活病毒攻毒保护实验
评价RV-1730对SARS-CoV-2野生型和Delta变异株感染的保护效果。
K18-hACE2小鼠免疫RV-1730或对照后，在第28天用致死剂量病毒攻毒，监测生存率、临床评分、体重变化并检测病毒滴度和病理。
异源加强免疫评估
评估RV-1730作为异源加强剂对已接种BNT162b2或mRNA-1273小鼠的免疫增强效果。
小鼠先接受BNT162b2、mRNA-1273或RV-1730初免和加强，第72天再接受RV-1730加强，分析血清IgG和中和抗体及T细胞反应。
二价疫苗评估
评估RV-1731（Delta+BA.1）的免疫原性和对新兴变异株的中和能力。
小鼠免疫RV-1731或对照，检测针对Delta和XBB1.5 RBD的IgG、假病毒中和活性及T细胞反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 体外转录 | CleanCap AG | TriLink | -- |
| N1-甲基假尿苷三磷酸 | -- | -- | |
| 疫苗配制 | NanoAssemblr Ignite | Precision NanoSystems | -- |
| 疫苗表征 | Zeta粒径仪 | Malvern Pananalytical | -- |
| Quant-it Ribogreen检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| iBlot2转印系统 | Invitrogen | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| Azure ChemiDoc成像系统 | Azure Biosystem | -- | |
| 抗SARS-CoV-2 S2抗体 | Invitrogen | -- | |
| 抗SARS-CoV-2 S1抗体 | Invitrogen | MA5-36249 | |
| 抗SARS-CoV-2 RBD抗体 | Invitrogen | MA5-36253 | |
| ELISA | MaxiSorp板 | BioLegend | -- |
| 重组S1蛋白（Alpha） | Sino Biological | 40591-V08H12 | |
| 重组S1蛋白（Beta） | Sino Biological | 40591-V08H15 | |
| 重组S1蛋白（Gamma） | Sino Biological | 40589-V08H26 | |
| 重组S1蛋白（Delta） | Sino Biological | 40150-V08B1 | |
| 重组S1蛋白（BA.1） | Sino Biological | 40591-V08H41 | |
| 重组S1蛋白（BA.2） | Sino Biological | 40589-V08H28 | |
| 重组RBD蛋白（WT） | Sino Biological | 40592-V08H | |
| 重组RBD蛋白（Alpha） | Sino Biological | 40592-V08H82 | |
| 重组RBD蛋白（Beta） | Sino Biological | 40592-V08H85 | |
| 重组RBD蛋白（Delta） | eEnzyme | SCV2-RBD-IN2P | |
| 重组RBD蛋白（BA.1） | Sino Biological | 40592-V08H121 | |
| 重组RBD蛋白（BA.2） | Sino Biological | 40592-V08H123 | |
| 重组RBD蛋白（XBB.1.5） | Sino Biological | 40591-V08H47 | |
| HRP标记抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2c抗体 | Abcam | -- | |
| TMB底物 | -- | -- | |
| Cytation7 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 抗兔IgG(H+L)-FITC | -- | -- |
| 抗FLAG M2-FITC | -- | -- | |
| DAPI | BD Pharmingen | 564907 | |
| BD FACSCelesta | -- | -- | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot PLUS（HRP）试剂盒 | Mabtech | -- |
| PepMix™ SARS-CoV-2（Spike B.1.617.2/Delta） | JPT Peptide Technologies GmbH | -- | |
| 细胞内细胞因子染色 | 布雷菲德菌素A | Biolegend | -- |
| 抗小鼠CD16/CD32抗体 | -- | -- | |
| 抗CD3-FITC | Biolegend | -- | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | -- | |
| CD8-BV650 | Biolegend | -- | |
| 抗IFN-γ-PE | Biolegend | -- | |
| 细胞因子定量 | 小鼠11重检测试剂盒 | -- | -- |
| Luminex100/200仪器 | Luminex | -- | |
| 假病毒中和试验 | ZymoPURE II质粒中提试剂盒 | Zymo Research | -- |
| Lipofectamine 3000试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 萤火虫荧光素酶检测试剂盒 | Codex BioSolutions Inc | -- | |
| 多聚D赖氨酸 | Trevigen | -- | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | -- | |
| PRNT | Vero-E6细胞 | -- | -- |
| 1%结晶紫 | -- | -- | |
| 组织病理学 | 10%福尔马林 | -- | -- |
| 小鼠实验 | K18-hACE2小鼠 | The Jackson Laboratory | -- |
| Balb/c小鼠 | The Jackson Laboratory | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外表达验证 | 细胞系：HEK293T；转染mRNA类型（WT S2P/D614G、Delta S2P、Delta S6P）；转染后检测时间（48小时） 阅读提示：Methods: Cell culture; Results: Figure 1 legend |
| 小鼠免疫原性评估 | 小鼠品系：雌性Balb/c；年龄：6-8周；免疫剂量：1、5、10、20 μg；免疫方案：第0天和第21天；采血时间：第14天和第35天 阅读提示：Methods: Immunization studies; Results: Figure 2 legend |
| 活病毒攻毒保护实验 | 小鼠品系：雌性K18-hACE2；年龄：6-8周；免疫剂量：0.5、1、5、10 μg；免疫方案：第0天和第14天；攻毒毒株和剂量：WT 5.5×10^4 PFU/只，Delta 1.5×10^4 PFU/只 阅读提示：Methods: Live virus challenges; Results: Figure 4 and 5 legends |
| 异源加强免疫评估 | 初始疫苗：BNT162b2、mRNA-1273、RV-1730；剂量：5 μg/只；加强剂量：2.5 μg/只；时间：第0、21、72天；采血时间点：14、35、49、63、77、105天 阅读提示：Methods: Immunization studies; Results: Figure 6 and 7 legends |
| 二价疫苗评估 | 免疫疫苗：RV-1731；对照疫苗：商业二价疫苗；检测变异株：XBB1.5、JN.1 阅读提示：Methods: Immunization studies; Results: Figure 9 legend |