建立共培养系统
比较PD-1和BTLA的抑制功能
使用Jurkat T细胞和Raji B细胞共培养，通过SEE超抗原刺激TCR，同时表达PD-L1或HVEM作为配体，检测IL-2分泌。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PD-1和BTLA通过SHP1和SHP2差异且仅部分调控T细胞信号传导
PD-1 and BTLA regulate T cell signaling differentially and only partially through SHP1 and SHP2.
实验完整度
高包含多种实验体系：生化重建、工程细胞系、原代T细胞、小鼠模型等，并进行功能验证（IL-2、磷酸化）和机制验证（相互作用、PTPase活性）。
主要模型
Jurkat T细胞与Raji B细胞共培养系统 小鼠原代CD8+ T细胞 OT-1 CD8+ T细胞 SHP1/2双敲除小鼠
重点核对
PD-1与SHP2的相互作用是否依赖于SHP2的磷酸化状态 BTLA与SHP1的相互作用是否依赖于Y257和Y282的磷酸化 SHP1/2双敲除条件下PD-1介导的抑制是否持续存在 PD-L1-Fc和HVEM-Fc的浓度依赖性效应
摘要
Xu等人表明，免疫检查点受体PD-1和BTLA分别通过弱磷酸酶SHP2和强磷酸酶SHP1抑制T细胞功能，从而避免竞争。令人惊讶的是，在SHP1和SHP2均缺失的情况下，两种受体仍能发挥部分抑制作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PD-1和BTLA在信号传导机制上有何差异，以及它们是否依赖于SHP1和SHP2来发挥抑制作用？
- 核心机制
- PD-1优先招募弱磷酸酶SHP2，BTLA优先招募强磷酸酶SHP1，从而差异调控CD28和CD3ζ的磷酸化，且两者均存在SHP1/2非依赖的抑制机制。
- 主要证据
- 通过共免疫沉淀、质谱、TIRF显微镜、FRET重建实验等，发现在SHP1/2双缺陷的原代T细胞中PD-1和BTLA仍能抑制增殖和细胞因子产生。
- 研究意义
- PD-1和BTLA的差异化信号机制可能解释其功能协同作用，并为癌症免疫治疗中联合阻断PD-1和BTLA提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测受体磷酸化及下游信号
比较PD-1和BTLA对CD3ζ和CD28磷酸化的影响
通过免疫印迹检测CD3ζ-pY142和CD28结合p85水平。
鉴定受体相互作用蛋白
确定PD-1和BTLA招募的胞内效应分子
通过GST pull-down和质谱分析，以及免疫共沉淀验证。
分析受体与配体的共定位和招募
在细胞膜水平观察SHP1/2的招募
使用平面脂双层（PLB）和TIRF显微镜观察OT-1细胞中PD-1或BTLA微聚簇对SHP1/2的招募。
验证SHP1/2在信号传导中的作用
确定SHP1和SHP2缺失对PD-1和BTLA功能的影响
利用CRISPR/Cas9敲除SHP1/2，检测IL-2分泌和受体磷酸化。
评估原代T细胞中SHP1/2非依赖功能
测试PD-1和BTLA在SHP1/2缺失时是否仍抑制T细胞功能
从dLck-Cre;Ptpn6fl/fl;Ptpn11fl/fl小鼠中分离CD8+ T细胞，用Dynabeads刺激，加入PD-L1-Fc或HVEM-Fc，检测增殖和细胞因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | 10-041-CM |
| DMEM培养基 | Genesee Scientific | 25-501 | |
| 胎牛血清 | Omega Scientific | FB-02 | |
| 青霉素-链霉素 | GE Healthcare | SV30010 | |
| 转染 | Lipofectamine转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 18324010 |
| 脂质体制备 | POPC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| DGS-NTA-Ni | Avanti Polar Lipids | 790404C | |
| PEG5000-PE | Avanti Polar Lipids | 880230C | |
| Rhod-PE | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| 免疫沉淀 | PY20抗体 | Sigma-Aldrich | P4110 |
| 抗人CD28抗体 | Thermo Fisher Scientific | 16-0289-85 | |
| 抗GFP抗体 | Thermo Fisher Scientific | A6455 | |
| 流式细胞术 | 抗人PD-1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-9969-42 |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10004D |
| 免疫印迹 | 抗人p85抗体 | Cell Signaling Technology | 4292S |
| 抗人CD3ζ-pY142抗体 | BD Biosciences | 558489 | |
| 免疫沉淀 | GFP-Trap | Chromotek | gta-20 |
| 免疫印迹 | 抗人SHP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7289 |
| 抗人SHP2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7384 | |
| 抗人CSK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166560 | |
| 抗人SAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393948 | |
| 抗人GRB2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8034 | |
| 抗GAPDH多克隆抗体 | Proteintech Group | 10494-1-AP | |
| 流式细胞术 | 抗人BTLA PE | BioLegend | 344505 |
| 抗人CD28 APC | BioLegend | 302911 | |
| 抗人HVEM APC | BioLegend | 318807 | |
| 抗人PD-L1 APC | BioLegend | 393609 | |
| 免疫印迹 | 抗人ZAP-70抗体 | BioLegend | 313402 |
| 原代T细胞分选 | 抗小鼠CD4生物素 | BioLegend | 100508 |
| 抗小鼠CD8生物素 | BioLegend | 100704 | |
| 抗小鼠CD44生物素 | BioLegend | 103004 | |
| 抗小鼠CD45RA/B220生物素 | BioLegend | 103204 | |
| 抗小鼠CD25生物素 | BioLegend | 102004 | |
| 抗小鼠NK1.1生物素 | BioLegend | 108703 | |
| 抗小鼠CD11b生物素 | BioLegend | 101204 | |
| 抗小鼠CD11c生物素 | BioLegend | 117304 | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠IL-2 FITC | BioLegend | 503806 |
| 抗小鼠PD-1 FITC | BioLegend | 135214 | |
| T细胞刺激 | 抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100331 |
| 抗小鼠CD28抗体 | BioLegend | 102112 | |
| 重组小鼠HVEM-Fc融合蛋白 | BioLegend | 771306 | |
| 细胞分选 | BeaverBeads链霉亲和素磁珠 | Beaver Beads | 22307-10 |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD8 APC-eFluor 780 | eBioscience | 47-0081-82 |
| 抗小鼠CD44 eFluor 450 | eBioscience | 48-0441-82 | |
| 抗小鼠CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| 抗小鼠IFN-γ PE | eBioscience | 12-7311-82 | |
| 增殖检测 | CTV细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C34557 |
| 细胞培养 | 重组小鼠IL-2 | Thermo Fisher Scientific | 14802164 |
| T细胞刺激 | 小鼠IgG | Sino Biological | 10690-MNAH |
| 重组小鼠PD-L1-Fc融合蛋白 | Sino Biological | 50010-M02H | |
| 再刺激 | 佛波酯 | Sigma-Aldrich | P1585-1MG |
| 离子霉素 | Merck | 407950-5MGCN | |
| GolgiStop蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 554724 | |
| 胞内染色 | 固定/破膜溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 重组蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 88223 |
| StrepTrap HP层析柱 | GE Healthcare | 95056-056 | |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B | GoldBio | G-250 | |
| 脂质体制备 | 聚碳酸酯滤膜 | -- | -- |
| 蛋白表达 | Bac-to-Bac杆状病毒系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 电穿孔 | Gene Pulser Xcell电穿孔仪 | Bio-Rad | -- |
| 流式分选 | FACSAria Fusion流式分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 荧光检测 | Tecan Spark 20酶标仪 | Tecan | -- |
| 超速离心 | TLA120转子 | Beckman Coulter | -- |
| 显微镜 | Nikon Eclipse Ti显微镜 | Nikon | -- |
| Andor iXon Ultra 897相机 | Andor | -- | |
| 质谱分析 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1000液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ReproSil-pur 120 C18-AQ | Dr. Maisch GmbH | -- | |
| 细胞培养 | SIINFEKL肽 | Anaspec | AS-60193-1 |
| PLB制备 | Hellmanex III清洗剂 | Hëlma Analytics | Z805939 |
| Nunc密封膜 | Thermo Fisher Scientific | 232698 | |
| 小鼠ICAM-His | Sino Biological | 50440-M08H | |
| 小鼠CD86-His | Sino Biological | 50068-M08H | |
| 小鼠PD-L1-His | Sino Biological | 50010-M08H | |
| 小鼠HVEM-His | BioLegend | 771304 | |
| 人ICAM-1-His | Sino Biological | 10346-H08H | |
| 人PD-L1-His | Sino Biological | 10084-H08H | |
| T细胞染色 | 抗小鼠TCRβ抗体 | BioLegend | H57-597 |
| Alexa647-抗CD3ε抗体 | BioLegend | 317312 | |
| ELISA | IL-2 ELISA试剂盒 | BioLegend | 431804 |
| 蛋白质纯化 | 3C蛋白酶 | -- | -- |
| TCEP | -- | -- | |
| d-脱硫生物素 | Sigma-Aldrich | D1411-1G | |
| 谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I202 | |
| 质谱样品处理 | 二硫苏糖醇 | Acros Organics | 16568-0050 |
| 胰蛋白酶 | Promega | V511A | |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | 5330050050 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 共培养实验 | Jurkat细胞类型（来源），Raji细胞配体表达，SEE浓度，共培养时间，IL-2检测方法 阅读提示：Materials and methods: Jurkat-Raji co-culture assay; Fig. 1 legend |
| 免疫沉淀 | 抗体特异性，GFP-Trap效率，裂解缓冲液成分 阅读提示：Materials and methods: Jurkat-Raji co-culture assay; Fig. 2 legend |
| PLB实验 | 脂质组成，蛋白浓度，固定条件 阅读提示：Materials and methods: OT-1: PLB imaging assay; Fig. 2D legend |
| 原代T细胞实验 | 小鼠基因型，细胞分选纯度，Dynabeads包被蛋白量，PD-L1-Fc或HVEM-Fc浓度 阅读提示：Materials and methods: Dynabead coating for CD8+ T cell stimulation; Fig. 7 legend |
| FRET实验 | 脂质体成分，蛋白浓度，ATP浓度 阅读提示：Materials and methods: FRET assays with protein-reconstituted LUVs; Fig. 5 legend |