临床样本单细胞测序表征
揭示CAR-T治疗后复发时肿瘤细胞和免疫细胞的转录组特征
对一例接受Cilta-cel治疗的复发/难治性MM患者的骨髓样本（治疗前、完全缓解和复发期）进行流式分选和单细胞RNA测序，分析CAR-T细胞、内源性T细胞和骨髓瘤细胞的转录组。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
骨髓瘤细胞内源性ANXA1升高和T细胞功能障碍导致CAR-T治疗后BCMA阴性复发
Myeloma cell-intrinsic ANXA1 elevation and T cell dysfunction contribute to BCMA-negative relapse after CAR-T therapy
实验完整度
高包含单细胞测序、CRISPR-Cas9基因编辑、体外功能验证（增殖、凋亡、杀伤实验）及体内小鼠模型等多个独立证据层级，并进行了机制验证（AMPKα信号通路）。
主要模型
8226细胞系 U266细胞系 MM.1S细胞系 NSG小鼠皮下移植瘤模型 患者骨髓样本（#02-041）
重点核对
BCMA阴性骨髓瘤细胞的比例和ANXA1表达水平 TNFRSF17基因敲除的效率和特异性 ANXA1过表达或敲低对细胞增殖和AMPKα磷酸化的影响 CAR-T细胞与骨髓瘤细胞共培养时的效应细胞与靶细胞比例（E:T） WRW4处理剂量和时间（体内外）
摘要
多发性骨髓瘤（MM）在抗B细胞成熟抗原（BCMA）嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞治疗后获得持久缓解后仍会复发，但相关因素尚不明确。本研究通过单细胞转录组测序研究了一名接受CAR-T治疗暴露的MM患者，该患者在缓解12个月后复发。复发时骨髓中的CAR-T细胞群表现出耗竭和增殖减弱。复发的骨髓瘤细胞缺乏或弱表达TNFRSF17（BCMA），但与基线肿瘤具有相同的免疫球蛋白克隆性。有趣的是，结合骨髓瘤细胞系的转录组谱，BCMA阴性的MM细胞以高ANXA1表达为特征，且ANXA1被确定为MM患者的不良预后指标。在单细胞分辨率下，BCMA阴性骨髓瘤可出现在未接受CAR-T细胞治疗的MM患者中，并显示出内在ANXA1转录水平升高。体外实验揭示，Annexin A1（ANXA1）升高通过AMPKα信号激活赋予BCMA阴性骨髓瘤细胞生长能力，并损害CAR-T细胞适应性。阻断Annexin A1可减少BCMA阴性骨髓瘤细胞的增殖。小鼠模型进一步证明，抑制Annexin A1可有效减少逃逸CAR-T攻击的BCMA阴性骨髓瘤。总之，我们的数据将ANXA1确定为清除BCMA阴性骨髓瘤的潜在靶点。ANXA1靶向策略可能有助于CAR-T治疗的优化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BCMA阴性骨髓瘤细胞如何在CAR-T治疗后存活并导致复发，以及是否存在针对该逃逸机制的干预靶点？
- 核心机制
- BCMA阴性骨髓瘤细胞通过上调ANXA1表达，激活AMPKα信号通路，从而获得增殖优势；同时ANXA1升高可诱导CAR-T细胞功能障碍（表现为PD-1和TIGIT上调、氧化应激增加），共同促进肿瘤逃逸。
- 主要证据
- 单细胞测序发现复发患者骨髓中BCMA阴性克隆高表达ANXA1；功能实验证明CRISPR-Cas9敲除TNFRSF17后ANXA1表达升高并促进增殖；ANXA1敲低或抑制剂WRW4可抑制BCMA阴性骨髓瘤生长并恢复CAR-T杀伤功能；小鼠模型证实ANXA1抑制策略有效。
- 研究意义
- ANXA1可作为BCMA阴性骨髓瘤清除的潜在治疗靶点，ANXA1靶向策略可能有助于CAR-T治疗优化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定BCMA阴性骨髓瘤亚群
确认BCMA阴性骨髓瘤细胞的存在及其克隆起源
通过单细胞转录组数据分析，鉴定TNFRSF17（BCMA）阴性表达的骨髓瘤细胞亚群，并通过免疫球蛋白克隆性分析确认其与基线肿瘤的克隆同源性。
验证BCMA缺失对骨髓瘤细胞增殖的影响
研究BCMA缺失是否赋予骨髓瘤细胞增殖优势
在8226、U266和MM.1S细胞系中通过CRISPR-Cas9敲除TNFRSF17，检测细胞增殖能力、凋亡及对CAR-T杀伤的敏感性。
鉴定BCMA阴性骨髓瘤中ANXA1及其功能研究
寻找BCMA缺失后上调的关键基因并验证其对骨髓瘤增殖和CAR-T功能的影响
对BCMA敲除的8226细胞进行转录组测序，与患者复发样本比较，筛选重叠上调基因；验证ANXA1表达变化，并研究ANXA1过表达或敲低对细胞增殖、AMPKα磷酸化及CAR-T细胞活性的影响。
验证ANXA1对CAR-T细胞功能的影响
探究ANXA1是否损害CAR-T细胞功能及机制
将CAR-T细胞与BCMA阴性骨髓瘤细胞共培养，加入重组人ANXA1或FPR2拮抗剂WRW4，检测CAR-T细胞活化标志（CD69）、抑制性受体（PD-1、TIGIT）、氧化应激（CM-H2DCFDA、MitoSOX）和杀伤能力。
体内验证ANXA1抑制策略对BCMA阴性骨髓瘤的疗效
评估ANXA1抑制（WRW4）单独或联合CAR-T对BCMA阴性骨髓瘤的抑制效果
建立8226皮下移植瘤模型（vector或sgBCMA-6），给予CAR-T细胞和/或WRW4治疗，监测肿瘤体积变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式分选 | BD AriaIII分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | LSRII流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 单细胞测序 | Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞3'试剂盒版本2 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina Xten平台 | Illumina | -- | |
| Western blot | Immobilon Western化学发光HRP底物试剂盒 | Millipore | -- |
| PVDF膜 | Cytive | -- | |
| SDS-PAGE预制胶 | Genescript | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| DMEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 基因编辑 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| 聚凝胺 | Sigma | -- | |
| ELISA | Annexin A1 ELISA试剂盒 | Abcam | ab222868 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D | D6050 | |
| 细胞分选 | Pan T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-535 |
| CAR-T制备 | CD3/CD28磁珠 | Life Technologies | -- |
| OpTmizer CTS培养基 | Life Technologies | -- | |
| 重组人白细胞介素-2 | Peprotech | 200-02 | |
| CAR-T转导效率检测 | 重组BCMA蛋白 | Acro Biosystems | BCA-HF254 |
| 细胞培养 | MycoBlue支原体检测试剂 | Vazyme | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Life Technologies | -- |
| RNA测序文库 | NEBNext PolyA mRNA磁珠分离模块 | New England Biolabs | -- |
| NEB Next Ultra方向性RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | -- | |
| 荧光素酶杀伤实验 | 荧光素酶细胞裂解缓冲液 | Promega | #E1531 |
| 荧光素酶检测底物 | Promega | #E1501 | |
| Infinite 200 PRO酶标仪 | TECAN | -- | |
| 免疫荧光 | Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 |
| 抗钙联蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2679 | |
| 抗BCMA抗体 | Cell Signaling Technology | 88183 | |
| 抗Annexin A1抗体 | Cell Signaling Technology | 32934 | |
| 抗Ki-67抗体 | EPITOMICS | 2746-1 | |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗磷酸化AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 抗磷酸化S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 抗磷酸化Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗PD-1抗体 | Cell Signaling Technology | 86163 | |
| 抗TIGIT抗体 | Cell Signaling Technology | 99567 | |
| 流式分析 | 7-AAD染色液 | BD Biosciences | #559925 |
| CD138抗体 | BD Biosciences | #562097 | |
| CD3抗体 | BD Biosciences | #557597 | |
| CD45抗体 | BD Biosciences | #560178 | |
| CD138抗体 | Beckman Coulter Life Science | #A87787 | |
| CD38抗体 | BD Biosciences | #563251 | |
| CD19抗体 | BD Biosciences | #341103 | |
| CD56抗体 | BD Biosciences | #565139 | |
| BCMA抗体 | Miltenyi Biotec | #130-118-970 | |
| CD69抗体 | BD Biosciences | #555533 | |
| PD-1抗体 | BioLegend | #329917 | |
| 氧化应激检测 | CM-H2DCFDA荧光探针 | Thermo Fisher | #C6827 |
| MitoSOX红色荧光探针 | Thermo Fisher | #M36007 | |
| 体内实验 | WRW4（FPR2拮抗剂） | Selleck Chemicals | S9818 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本单细胞测序 | 患者#02-041的治疗史和样本采集时间点；样本分选策略（CD3+和CD138+选择）；单细胞测序平台和文库制备条件 阅读提示：见Methods中Patient and sample acquisition和Cell resuscitation, microscopic examination, 10× Genomics library construction, and scRNA-seq部分 |
| BCMA敲除与细胞增殖 | TNFRSF17 sgRNA序列；CRISPR-Cas9转染条件；细胞增殖检测的起始细胞数和检测时间点 阅读提示：见Methods中CRISPR-Cas9 gene editing部分和Figure 3B legend |
| ANXA1功能实验 | ANXA1过表达和敲低的构建方法；Western blot检测的抗体和稀释比例；AMPKα磷酸化的定量方法 阅读提示：见Methods中Western blotting部分和Figure 4 legend |
| CAR-T共培养实验 | CAR-T细胞的制备方法（转导效率和培养条件）；共培养体系中的E:T比例；rhANXA1和WRW4的处理浓度和时间 阅读提示：见Methods中CAR-T cell manufacturing和Car-T共培养相关结果部分（Figure 5） |
| 体内动物实验 | NSG小鼠品系和注射细胞数量；CAR-T细胞注射时间和数量；WRW4的剂量、给药途径和频率；肿瘤体积测量方法 阅读提示：见Methods中Animal studies部分和Figure 5I-J legend |