体外验证RfxCas13d敲低效率
筛选有效的crRNA并确认RfxCas13d能高效敲低靶基因。
设计靶向Sik3-S、Map2、Mapt、Rbfox3、tdTomato等基因的crRNA，在N2a或HEK293T细胞中共转染RfxCas13d和crRNA，通过RT-qPCR检测敲低效率。
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RfxCas13d的附带活性可在RfxCas13d敲入小鼠模型中诱导致死性
The collateral activity of RfxCas13d can induce lethality in a RfxCas13d knock-in mouse model
实验完整度
高包括体外细胞实验、基因敲除小鼠模型、AAV介导的体内敲低、转录组分析、机制研究（28s rRNA切割、信号通路验证）等多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞 N2a细胞 LSLRfxCas13dfl/fl敲入小鼠 Sik3-E5fl/fl小鼠
重点核对
脑神经元中RfxCas13d介导的基因敲低导致小鼠死亡，非靶基因功能丧失或脱靶效应所致 RfxCas13d附带活性与靶RNA丰度正相关 RfxCas13d附带活性切割28s rRNA为两个片段 激活ZAKα-JNK/p38-即早基因通路 成年小鼠大脑神经元中RfxCas13d表达条件（如AAV-PHP.eB递送）
摘要
背景：CRISPR-Cas13系统是一种RNA引导的RNA靶向系统，已广泛用于转录组工程，具有潜在的临床应用。然而，Cas13是否在哺乳动物细胞中表现出附带活性仍存在争议。结果：在这里，我们发现使用RfxCas13d在成年大脑神经元中敲低基因表达导致小鼠死亡，这可能归因于RfxCas13d的附带活性而非靶基因功能丧失或脱靶效应。机制上，我们证明RfxCas13d在哺乳动物细胞中表现出附带活性，其与靶RNA的丰度呈正相关。RfxCas13d的附带活性可将28s rRNA切割成两个片段，导致翻译衰减和ZAKα-JNK/p38-即早基因通路的激活。结论：这些发现为RfxCas13d在哺乳动物细胞中的附带活性提供了新的机制见解，并警示CRISPR-Cas13系统的生物安全性在应用于临床治疗前需要进一步评估。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RfxCas13d是否在哺乳动物细胞中表现出附带活性，以及其在动物体内敲低基因表达是否安全？
- 核心机制
- RfxCas13d在哺乳动物细胞中表现出附带活性，其与靶RNA丰度正相关；该活性切割28s rRNA为两个片段，导致翻译衰减并激活ZAKα-JNK/p38-即早基因通路。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中通过靶向高丰度外源或内源基因诱导RfxCas13d附带活性，检测到28s rRNA切割、翻译抑制和IEG上调；在LSLRfxCas13dfl/fl小鼠中，神经元特异性敲低多个基因（如Sik3-S、Map2、Mapt、Rbfox3、tdTomato）导致死亡，而敲除Sik3或单独表达RfxCas13d未致死。
- 研究意义
- 揭示了RfxCas13d附带活性的机制，警示CRISPR-Cas13系统在临床应用前需进一步评估其生物安全性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证神经元中基因敲低对小鼠的影响
评估在成体脑神经元中敲低特定基因（包括非必需基因）是否影响小鼠存活。
使用LSLRfxCas13dfl/fl小鼠，通过AAV-PHP.eB递送U6驱动的crRNA和hSYN驱动的Cre，在脑神经元中表达RfxCas13d并敲低靶基因，监测小鼠体重和生存。
排除靶基因功能丧失导致死亡
确定小鼠死亡是否由靶基因功能缺失引起。
利用Sik3-E5fl/fl小鼠敲除Sik3，或靶向已知敲除不致死基因（Map2、Mapt、Rbfox3），观察小鼠存活。
验证死亡由RfxCas13d附带活性而非脱靶效应引起
区分RfxCas13d的附带活性与脱靶效应。
在LSLRfxCas13d+/flAi14+/fl小鼠中，仅当RfxCas13d、tdTomato和tdTomato crRNA 7同时存在时小鼠死亡，单独之一不致死。
体外验证RfxCas13d附带活性与靶RNA丰度的相关性
证实RfxCas13d附带活性在哺乳动物细胞中存在，并检测其与靶RNA丰度的相关性。
在HEK293T细胞中，通过转染RfxCas13d、靶基因和crRNA，或使用可诱导表达系统，检测RfxCas13d自身表达水平及靶基因敲低情况，评估附带活性。
机制研究：28s rRNA切割及下游通路
阐明RfxCas13d附带活性的分子机制。
在HEK293T-RfxCas13d细胞中诱导附带活性，分析总RNA完整性、翻译速率、细胞周期、转录组、信号通路蛋白磷酸化，并通过基因敲除验证ZAKα的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 764582 |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 114-15 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TIANGEN | DP424 |
| 逆转录 | HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒 | Vazyme | R223-01 |
| qPCR | SYBR Green荧光染料 | Vazyme | Q311 |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Targetmol | C0001 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Targetmol | C0003 | |
| SUnSET | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 细胞周期分析 | DAPI染色液 | Beyotime | C1005 |
| 细胞培养 | 1640培养基 | -- | -- |
| AAV包装 | PEI MAX转染试剂 | Polysciences | 24765 |
| AAV纯化 | Benzonase核酸酶 | Milipore | E1014 |
| 碘克沙醇 | Optiprep | D1556 | |
| Amicon超滤管 | EMD | UFC801096 | |
| AAV注射 | Pluronic F68 | Gibco | 24040032 |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖珠 | -- | -- |
| ULP1蛋白酶 | -- | -- | |
| Superdex G-200凝胶过滤柱 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| RNA连接 | T4 RNA连接酶1 | NEB | M0204S |
| RNA逆转录 | R1引物 | Vazyme | R312-02 |
| PCR产物纯化 | TIANgel Midi纯化试剂盒 | Tiangen | DP209 |
| 克隆 | T载体 | Transgen Biotech | CT101-01 |
| RNA完整性分析 | Agilent 2200生物分析仪 | Agilent | -- |
| RNA变性凝胶电泳 | MOPS电泳缓冲液 | Sangon Biotech | C516042-0001 |
| 上样缓冲液 | Sangon Biotech | B548318-0001 | |
| 甲醛 | -- | -- | |
| 甲酰胺 | -- | -- | |
| 溴化乙锭 | -- | -- | |
| RNA提取 | DEPC水 | -- | -- |
| 蛋白质印迹 | 硝酸纤维素膜 | Pall | P-N66485 |
| 抗Cre抗体 | CST | 15036T | |
| 大鼠抗HA抗体 | Roche | 11867423001 | |
| 兔抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| 抗SIK3抗体 | self-made | -- | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | TransGen Biotech | HC101 | |
| 抗ACTB抗体 | Proteintech | 60008-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗NeuN抗体 | Proteintech | 26975-1-AP | |
| 抗Tau抗体 | Proteintech | 10274-1-AP | |
| 抗MAP2抗体 | Proteintech | 17490-1-AP | |
| 抗ZAK抗体 | Proteintech | 28761-1-AP | |
| 抗PKR抗体 | Proteintech | 18244-1-AP | |
| 抗磷酸化p38抗体 | CST | 4511 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | CST | 4370 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | HUABIO | ET1609-42 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP标记的重组兔抗小鼠IgG kappa轻链 | Proteintech | SA00001-1 | |
| In vitro切割 | 淬灭荧光RNA报告分子 | General Biology | -- |
| 信号通路抑制 | SB203580 | MCE | HY-10256 |
| SP600125 | MCE | HY-12041 | |
| U0126 | MCE | HY-12031 | |
| RhoA/C抑制剂 | Selleck | S7719 | |
| ZAK抑制剂6P和HY180 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型构建 | LSLRfxCas13dfl/fl小鼠中RfxCas13d的表达是否由Cre重组酶诱导，以及AAV-PHP.eB递送的病毒滴度和注射剂量。 阅读提示：参见Methods中的Animals和AAV-PHP.eB packaging, purification, and injection部分 |
| 体外细胞实验 | 转染效率、细胞系选择（HEK293T、N2a）、质粒浓度、转染时间、靶基因表达水平 阅读提示：参见Methods中的Cell culture和Measurement of crRNAs’ knockdown efficiency部分 |
| 附带活性检测 | 靶RNA丰度、crRNA序列、RfxCas13d表达水平、检测指标（如RfxCas13d自身mRNA和蛋白水平） 阅读提示：参见Results中“The collateral activity of RfxCas13d was positively correlated with the abundance of target RNA”部分及图4 |
| 体内基因敲低 | AAV血清型（PHP.eB）、注射途径（retro-orbital）、病毒剂量（1×10^12 vg/鼠）、启动子（hSYN） 阅读提示：参见Methods中的AAV-PHP.eB packaging, purification, and injection部分 |
| 机制验证 | RfxCas13d表达细胞系（HEK293T-RfxCas13d）、靶基因和crRNA共转染条件、RNA完整性分析、SUnSET、细胞周期、RNA-seq及信号通路抑制剂使用 阅读提示：参见Results中“The collateral activity of RfxCas13d cleaved 28s rRNA...”部分及图5 |