药物筛选与鉴定
筛选能够抑制Warburg效应的天然小分子候选物。
通过数据挖掘和机器学习结合药效团虚拟筛选，从天然产物库中鉴定(+)-miliusol，并通过MTT等实验验证其抗增殖活性。
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(+)-Miliusol通过靶向EIF3D并重塑癌症代谢抑制三阴性乳腺癌中的Warburg效应并诱导调节性细胞死亡
(+)-Miliusol suppresses the Warburg effect and induces regulated cell death in triple-negative breast cancer through targeting EIF3D and remodeling cancer metabolism
实验完整度
高体外细胞实验（增殖、糖酵解、迁移、凋亡、自噬、ER应激）、多组学（RNA-seq、蛋白质组学）、靶点验证（MS-CETSA、PROTAC、SPR等）及体内小鼠和斑马鱼模型，包含多层次机制验证。
主要模型
BT-549细胞系 MDA-MB-231细胞系 BT-549和MDA-MB-231异种移植小鼠模型 斑马鱼肿瘤异种移植模型
重点核对
(+)-miliusol处理浓度和时间：2.5、5、10 μmol/L处理24或48小时 GLUT4表达及葡萄糖摄取检测 ECAR和OCR测量条件 EIF3D敲低对(+)-miliusol效应的影响 体内给药剂量：BT-549模型10 mg/kg，MDA-MB-231模型8 mg/kg
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）表现出显著的分子异质性，持续构成治疗挑战。代谢重编程，特别是通过Warburg效应，为TNBC治疗提供了一个有前景的治疗靶点。数据挖掘和机器学习将(+)-miliusol确定为有前景的候选药物。其直接靶点真核起始因子3D（EIF3D）通过质谱联用细胞热位移分析（MS-CETSA）、生物素化探针和蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）方法得到验证。EIF3D是一种新兴的癌蛋白和非典型翻译起始调节因子，通过选择性调节蛋白质合成促进肿瘤生存。(+)-Miliusol在体外和体内均表现出对TNBC有效的抗增殖和抗迁移活性。整合蛋白质组学和转录组学分析揭示，(+)-miliusol通过EIF3D介导的翻译调控抑制TNBC进展。机制上，它破坏EIF3D–AlkB同源物5（ALKBH5）–葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）轴、EIF3D–HIF1α信号传导以及EIF3D–RuvB样AAA ATP酶1（RUVBL1）–β-catenin通路，从而抑制糖酵解和转移，同时通过caspase-12和JNK激活诱导内质网应激依赖性凋亡。此外，(+)-miliusol阻断EIF3D–HIF1α和EIF3D–ALKBH3相互作用，损害ATAD2/PAK1调节的Warburg效应网络，并触发自噬相关的细胞死亡。(+)-Miliusol通过选择性抑制关键糖酵解和转移调节因子的翻译来诱导TNBC细胞死亡。这些发现确立了EIF3D介导的翻译控制作为TNBC治疗的一个有前景的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究试图探究(+)-miliusol能否通过靶向EIF3D抑制三阴性乳腺癌的Warburg效应，并阐明其抗肿瘤机制。
- 核心机制
- (+)-miliusol通过靶向EIF3D，抑制EIF3D-ALKBH5-GLUT4轴、EIF3D-HIF1α信号和EIF3D-RUVBL1-β-catenin通路，从而抑制糖酵解和转移，同时诱导内质网应激依赖的凋亡和自噬相关的细胞死亡。
- 主要证据
- 通过MS-CETSA、生物素化探针和PROTAC验证EIF3D为直接靶点；体外实验显示抑制细胞增殖、迁移和糖酵解；体内异种移植模型和斑马鱼模型证实抗肿瘤和抗转移效果；蛋白质组学和转录组学分析揭示相关通路变化。
- 研究意义
- 研究建立EIF3D介导的翻译控制作为TNBC治疗的一个有前景的途径，为开发靶向EIF3D的治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗肿瘤活性评估
验证(+)-miliusol对TNBC细胞增殖、糖酵解和迁移的抑制作用。
集落形成、3D球体形成、EdU、Ki-67染色检测增殖；2-NBDG摄取、乳酸生成、LDH活性、ECAR、OCR检测糖酵解；划痕和Transwell检测迁移；Western blot检测相关蛋白表达。
转录组和蛋白质组分析
揭示(+)-miliusol处理后的基因和蛋白表达变化，寻找关键调控因子。
对处理的细胞进行RNA-seq和TMT定量蛋白质组学分析，鉴定差异表达基因和蛋白，构建PPI网络。
靶点鉴定与验证
鉴定(+)-miliusol的直接蛋白靶点并验证其相互作用。
通过MS-CETSA、WB-CETSA、生物素化探针pull-down、PROTAC降解、SPR和分子对接验证EIF3D为直接靶点。
机制解析
阐明(+)-miliusol通过EIF3D调控的分子机制，包括对信号通路和细胞死亡的影响。
通过siRNA敲低EIF3D、PAK1、ATAD2，检测下游信号通路蛋白表达，自噬、凋亡、内质网应激标志物的检测。
体内药效评估
验证(+)-miliusol在体内的抗肿瘤和抗转移效果及安全性。
在BT-549和MDA-MB-231异种移植小鼠模型中评估肿瘤生长抑制、生存期、转移和安全性；在斑马鱼模型中评估荧光强度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC）及培养基、血清浓度和抗生素条件 阅读提示：Methods 2.2 Cell culture |
| 药物处理 | (+)-miliusol的浓度范围和处理时间（例如5 μmol/L处理24或48小时） 阅读提示：Figure legends和Methods相关部分 |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖摄取实验中2-NBDG浓度和孵育时间；乳酸生成实验的细胞密度和处理时间 阅读提示：Methods 2.10和2.11 |
| 自噬检测 | 自噬抑制剂（3-MA或CQ）的浓度和处理时间；RFP-GFP-LC3转染条件 阅读提示：Methods 2.14, 2.16；Figure 5和图例 |
| 体内实验 | 小鼠品系、细胞接种数量、给药剂量、给药频率和时长（如(+)-miliusol 10 mg/kg或8 mg/kg每天） 阅读提示：Methods 2.23和2.24 |