评估SLE患者中性粒细胞ROS水平和存活率
验证SLE中性粒细胞ROS水平是否升高并与疾病活动性和中性粒细胞减少相关
分离SLE和HC外周血中性粒细胞，用DCFH-DA探针检测ROS，用Annexin V/7AAD染色检测存活率，并分析相关性
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SLE中的氧化型半乳凝素-1无法结合抑制性受体VSTM1并增加中性粒细胞活性氧水平
Oxidized galectin-1 in SLE fails to bind the inhibitory receptor VSTM1 and increases reactive oxygen species levels in neutrophils
实验完整度
高包含患者样本、细胞系（dHL60、THP-1）和多种功能验证（siRNA、过表达、BLI、IP-MS等）及机制研究，证据层级独立。
主要模型
外周血中性粒细胞（来自SLE患者和健康对照） dHL60细胞（DMSO分化HL60） THP-1细胞（稳定转染VSTM1） HEK293T细胞（瞬时转染）
重点核对
患者入组年龄18-45岁且为治疗初治 血清刺激使用10%混合SLE或HC血清 Gal1浓度25 μg/mL处理 VSTM1敲低（siRNA）和过表达（慢病毒） 氧化型Gal1制备：CuSO4处理
摘要
抑制性免疫受体为免疫细胞激活设定阈值，其缺陷使个体易患自身免疫反应。然而，抑制性免疫受体的激动剂在很大程度上仍然未知，代表了自身免疫疾病治疗的未开发来源。在此，我们证明含V-set和跨膜结构域蛋白1（VSTM1）是一种抑制性受体，其与能力配体可溶性半乳凝素-1（Gal1）的结合对于通过下调活性氧产生来维持中性粒细胞存活至关重要。然而，在系统性红斑狼疮（SLE）患者中，循环中的Gal1被氧化，无法被VSTM1识别，导致细胞内活性氧水平升高和中性粒细胞存活率降低。中性粒细胞功能失调或死亡通过提供危险分子和自身抗原，驱动炎症细胞因子的产生和自身反应性淋巴细胞的激活，显著促进SLE的发病机制。有趣的是，血清中谷胱甘肽（一种能够将氧化型Gal1转化为其还原形式的抗氧化剂）水平与SLE疾病活动性呈负相关。总之，我们的发现揭示了SLE患者中抑制性Gal1/VSTM1通路激活失败，并为开发有效的靶向治疗提供了重要见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑制性受体VSTM1的配体是什么，及其在SLE中性粒细胞ROS产生和存活中的作用
- 核心机制
- Gal1作为VSTM1的配体，通过VSTM1抑制ROS产生和中性粒细胞死亡；SLE中Gal1氧化后无法结合VSTM1，导致ROS升高和细胞死亡，机制涉及GSH水平降低
- 主要证据
- 通过GST pull-down和质谱鉴定Gal1为VSTM1配体，BLI证实还原型Gal1结合VSTM1，氧化型不结合；SLE患者血清中Gal1氧化水平升高，GSH/（GSH+GSSG）比值降低并与疾病活动度负相关
- 研究意义
- 揭示Gal1/VSTM1轴在SLE发病中的作用，为靶向氧化应激治疗SLE提供理论基础
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定VSTM1对中性粒细胞ROS和存活的影响
确定VSTM1是否调节ROS产生和细胞存活
在dHL60细胞中进行siRNA筛选，敲低13个抑制性受体，检测ROS和存活；用抗VSTM1激动性抗体处理HC和SLE中性粒细胞检测ROS和存活
鉴定VSTM1的配体Gal1
找到VSTM1的天然配体
用GST-VSTM1胞外域进行pull-down，结合质谱鉴定；通过免疫共沉淀和结合实验确认；并验证Gal1对ROS和存活的影响
验证Gal1通过VSTM1抑制ROS产生
证实Gal1的ROS抑制作用依赖于VSTM1
在dHL60细胞中敲低VSTM1，在THP-1细胞中过表达VSTM1，检测Gal1处理后的ROS变化
检查SLE血清中Gal1的结合能力
确定SLE中Gal1与VSTM1的结合是否受损
通过免疫荧光检测VSTM1和Gal1共定位，免疫共沉淀检测结合，竞争结合实验比较HC和SLE血清对Gal1结合的抑制
分析SLE血清中Gal1的氧化状态
确定SLE中Gal1是否过度氧化
通过质谱检测氧化型半胱氨酸（Cys3-Cys43二硫键），BIAM标记还原型巯基，Western blot检测还原型及二聚体
测试氧化型Gal1对VSTM1的结合和功能影响
验证氧化型Gal1是否失去结合VSTM1及抑制ROS的能力
用BLI检测还原型和氧化型Gal1与VSTM1的亲和力；检测氧化型Gal1对dHL60细胞的结合、对ROS产生和细胞存活的影响，以及MAPK信号通路变化
评估血清GSH水平与Gal1氧化的关系
探讨SLE中GSH水平降低是否导致Gal1过度氧化
测量HC和多种自身免疫病患者血清中GSH/(GSH+GSSG)比值，并分析与疾病活动性、还原型Gal1水平及中性粒细胞计数的相关性；体外实验检测GSH和NAC对H2O2诱导的Gal1氧化的影响
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞分离 | Ficoll-Hypaque密度梯度离心液 | -- | -- |
| 细胞培养 | 抗CD14磁珠 | Miltenyi | 130050201 |
| 细胞分离 | 裂解缓冲液 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 药物处理 | N-乙酰半胱氨酸 | Selleck | S1623 |
| 谷胱甘肽 | Merck | G4251 | |
| GSK484 | Selleck | S7803 | |
| VX765 | Selleck | S2228 | |
| z-VAD | Selleck | S7023 | |
| 坏死性凋亡抑制剂-1 | Selleck | S8037 | |
| ROS检测 | 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Beyotime | S0033S |
| 细胞活力检测 | 膜联蛋白V-PE | BD Pharmingen | -- |
| 细胞处理 | β1-4半乳糖苷酶 | NEB | P0745S |
| 肽N-糖苷酶F | NEB | P0704S | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 膜和胞浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| TOP14高丰度蛋白去除离心柱 | Pierce | A36370 | |
| 抗VSTM1抗体 | Proteintech | 24382-1-AP | |
| 抗Gal1抗体 | Proteintech | 11858-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗Na-K-ATP酶抗体 | Cell Signaling Technology | 3010 | |
| 抗磷酸化p42抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗p42抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 | |
| 流式细胞术 | PE标记抗人CD11b抗体 | BioLegend | 301305 |
| FITC标记抗人CD11b抗体 | BioLegend | 982614 | |
| APC-Cy7标记抗人CD66b抗体 | BioLegend | 305126 | |
| BV650标记抗人CD62L抗体 | BioLegend | 304832 | |
| BV421标记抗人CD16抗体 | BioLegend | 302037 | |
| APC标记抗人CD181（CXCR1）抗体 | BioLegend | 320612 | |
| PerCP-Cy5.5标记抗人CD182（CXCR2）抗体 | BioLegend | 320718 | |
| APC标记抗人CD184（CXCR4）抗体 | BioLegend | 306509 | |
| BV605标记抗人CD10抗体 | BioLegend | 312221 | |
| PerCP-Cy5.5标记抗人CD54抗体 | BioLegend | 353120 | |
| FITC标记的驴抗兔IgG二抗 | BioLegend | 406403 | |
| PE标记的驴抗兔IgG二抗 | BioLegend | 406421 | |
| 抗VSTM1激动性单克隆抗体 | HycultBiotech | HM2309 | |
| 免疫共沉淀 | AminoLink Plus偶联树脂 | Thermo Scientific | 26149 |
| 链霉亲和素磁珠 | -- | -- | |
| 质谱分析 | LTQ Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| 蛋白质定量 | 人半乳凝素-1 ELISA试剂盒 | Abcam | ab260053 |
| 流式细胞术 | BD FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 蛋白质相互作用 | Octet Red96e系统 | -- | -- |
| 免疫荧光 | Leica显微镜 | Leica | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 转染 | RNAiMAX转染试剂 | Life Technology | -- |
| Lipo-2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT预混液 | Takara | -- |
| 7900HT Fast实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质标记 | Alexa Fluor 488标记试剂盒 | Abcam | ab236553 |
| 药物处理 | 半乳凝素-1重组蛋白 | Sino Biological | 10290-HNAE |
| VSTM1重组蛋白 | Sino Biological | 13171-H08H | |
| 蛋白纯化 | GST琼脂糖珠 | -- | -- |
| 蛋白处理 | 过氧化氢酶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者入组 | 患者年龄18-45岁，治疗初治，排除感染、肿瘤等合并症 阅读提示：Materials and methods: Patients and controls |
| 细胞分离培养 | 使用Ficoll-Paque密度梯度离心分离中性粒细胞，裂解红细胞；培养基含10%混合SLE或HC血清 阅读提示：Materials and methods: Cell isolation and culture |
| ROS检测 | DCFH-DA探针浓度10 μmol/L，孵育20分钟，37°C；检测时间0-2小时 阅读提示：Materials and methods: Measurement of intracellular ROS levels |
| 细胞活力检测 | 使用Annexin V-PE和7AAD染色，检测双阴性细胞比例作为存活细胞 阅读提示：Materials and methods: Cell viability quantification |
| VSTM1敲低 | siRNA浓度50 nM，转染72小时，使用RNAiMAX试剂 阅读提示：Materials and methods: RNA interference and plasmids |
| Gal1氧化处理 | 重组Gal1用20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 和0.001% CuSO4在4°C孵育过夜 阅读提示：Materials and methods: Gal1 oxidation |