体内炎症模型验证KDM2B对IL-6产生的影响
评估KDM2B在全身炎症反应和结肠炎中对IL-6产生及组织损伤的作用
利用CRISPR-Cas9生成的Kdm2b基因敲除小鼠，腹腔注射LPS或poly(I:C)建立内毒素休克模型，或给予3% DSS诱导结肠炎，检测血清细胞因子水平，并通过HE染色评估肺和结肠组织病理变化。
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KDM2B通过Brg1介导的染色质重塑促进IL-6产生和炎症反应
KDM2B promotes IL-6 production and inflammatory responses through Brg1-mediated chromatin remodeling
实验完整度
高包含KDM2B敲除小鼠模型、原代巨噬细胞和树突状细胞、体内内毒素休克和结肠炎模型、体外siRNA敲低及过表达回补，以及ChIP、DNase I、FAIRE、LC-MS等机制验证。
主要模型
小鼠原代腹腔巨噬细胞 骨髓来源巨噬细胞(BMDM) 骨髓来源树突状细胞(BMDC) Kdm2b基因敲除小鼠内毒素休克和结肠炎模型
重点核对
KDM2B在巨噬细胞和树突状细胞中对IL-6而非TNF-α、IFN-β等的诱导是必需的 KDM2B选择性结合Il6启动子但不改变H3K4me3和H3K36me2水平 KDM2B通过其LRR结构域与Brg1相互作用 KDM2B缺陷减少Brg1和RNA Pol II在Il6启动子的招募 Brg1敲低降低Il6启动子染色质可及性并抑制IL-6产生
摘要
IL-6在感染和炎症性疾病中发挥重要且多效性的作用，其产生需要被严格调控。然而，Il6基因转录的表观遗传机制尚未被完全阐明。在此，我们报道了赖氨酸特异性去甲基化酶2b（KDM2B），它能去甲基化H3K4me3和H3K36me2，在巨噬细胞和树突状细胞中对于IL-6的诱导是必需的，但对TNF-α、IL-1和IFN-β并非必需。与野生型小鼠相比，KDM2B缺陷小鼠对内毒素休克和结肠炎更具抵抗力，炎症病理表型较轻，血清中IL-6产生减少。KDM2B选择性结合Il6启动子，但不改变组蛋白去甲基化；相反，KDM2B与Brahma相关基因1（Brg1）相互作用，后者是SWI/SNF染色质重塑复合物的核心ATP酶亚基，以促进Il6启动子的染色质可及性。此外，KDM2B直接招募RNA聚合酶II，进一步启动和促进Il6转录。因此，我们的发现确定了KDM2B在基因特异性转录起始和增强Il6中的一种新的非经典功能，该功能不依赖于其去甲基化酶活性，并为炎症免疫反应的特异性表观遗传修饰机制增添了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KDM2B是否以及如何通过表观遗传机制调控炎症反应中的IL-6产生？
- 核心机制
- KDM2B不依赖其去甲基化酶活性，通过其LRR结构域与Brg1相互作用，将Brg1招募到Il6启动子，促进染色质开放，并进一步招募RNA聚合酶II，从而增强Il6转录。
- 主要证据
- KDM2B缺陷小鼠在LPS或poly(I:C)刺激下血清IL-6减少，且对内毒素休克和DSS诱导的结肠炎更具抵抗力；在巨噬细胞和树突状细胞中，KDM2B缺乏或敲低选择性地降低IL-6产生；ChIP、Re-ChIP、DNase I敏感性和FAIRE实验证明KDM2B与Brg1结合并促进Il6启动子染色质可及性；过表达KDM2B但非ΔLRR突变体可回补IL-6产生。
- 研究意义
- 该研究确定了KDM2B作为炎症的正调控因子，为IL-6的基因特异性表观遗传调控提供了新机制，提示选择性KDM2B抑制剂可能有效抑制炎症组织中的IL-6产生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞模型验证KDM2B对IL-6产生的选择性
确定KDM2B是否选择性调控巨噬细胞和树突状细胞中IL-6的表达
分离Kdm2b+/+和Kdm2b-/-小鼠的腹腔巨噬细胞、BMDM和BMDC，用LPS、poly(I:C)或病毒感染刺激，检测Il6 mRNA和IL-6蛋白水平；同时用siRNA敲低KDM2B，验证其对IL-6产生的必要性。
KDM2B对Il6启动子结合及组蛋白修饰的影响
验证KDM2B是否选择性结合Il6启动子并改变其组蛋白甲基化状态
通过ChIP-qPCR检测KDM2B在Il6、Tnf和Ifnb1启动子的占有率，并检测H3K4me3和H3K36me2的水平；利用Il6启动子荧光素酶报告基因实验检测KDM2B及其去甲基化酶失活突变体对Il6转录活性的影响。
KDM2B对Il6启动子染色质可及性的影响
检验KDM2B是否通过影响染色质开放性来调控Il6转录
采用DNase I敏感性分析和FAIRE实验比较Kdm2b+/+和Kdm2b-/-巨噬细胞中Il6、Tnf和Ifnb1启动子的染色质可及性。
KDM2B与Brg1相互作用及对Il6启动子染色质重塑的作用
鉴定KDM2B的相互作用蛋白并验证其介导Brg1招募至Il6启动子的机制
通过免疫沉淀结合质谱分析鉴定KDM2B相互作用蛋白，发现Brg1；通过免疫共沉淀验证内源相互作用并定位结合域；通过Re-ChIP和ChIP检测KDM2B和Brg1在Il6启动子的共定位以及KDM2B对Brg1招募的影响；通过siRNA敲低Brg1检测染色质可及性和IL-6产生。
KDM2B对RNA聚合酶II招募的影响
确定KDM2B是否通过招募RNA Pol II促进Il6转录
通过免疫共沉淀检测KDM2B与RNA Pol II的相互作用，并通过ChIP检测KDM2B缺陷对RNA Pol II在Il6启动子占位的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞刺激 | 脂多糖（大肠杆菌0111:B4） | Merck Millipore | -- |
| 聚肌胞苷酸 | Merck Millipore | -- | |
| 免疫印迹 | 抗KDM2B抗体 | Merck Millipore | 09-864 |
| 染色质免疫沉淀 | 抗KDM2B抗体 | Novus Biologicals | NBP2-14954 |
| 免疫沉淀 | 抗Brg1抗体 | Abcam | ab110641 |
| 免疫印迹 | 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9258 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 | |
| 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗IKKβ抗体 | Cell Signaling Technology | 8943 | |
| 抗磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 2697 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| 抗Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2044 | |
| 抗V5标签抗体 | Cell Signaling Technology | 13202 | |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 结肠炎模型 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 定量PCR | LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- |
| SYBR RT-PCR试剂盒 | Takara | -- | |
| RNA测序 | RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| TruSeq RNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫沉淀和免疫印迹 | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Calbiochem | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 质粒构建 | pcDNA3.1 V5-His真核表达载体 | Invitrogen | -- |
| p3xFLAG-CMV-14载体 | Sigma | -- | |
| 细胞转染 | 巨噬细胞核转染试剂盒 | Lonza | -- |
| 4D核转染系统 | Lonza | -- | |
| 质谱分析 | NE-PER核和胞质蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Millipore | -- |
| Re-ChIP | Re-ChIP-IT试剂盒 | Active Motif | -- |
| DNase I敏感性分析 | DNase I | Promega | -- |
| DNA纯化 | QIAamp DNA微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | JetPEI转染试剂 | Polyplus Transfection | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 内毒素休克模型 | Kdm2b+/+和Kdm2b-/-小鼠的周龄（6-8周）、LPS剂量（12 mg/kg）和poly(I:C)剂量（10 mg/kg）腹腔注射，血清采集时间（注射后2小时） 阅读提示：Materials and methods, Endotoxin shock model and colitis model; 图1a |
| 结肠炎模型 | DSS浓度（3% w/v）、分子量（36,000-50,000）、处理时间（7天）、小鼠周龄（6-8周） 阅读提示：Materials and methods, Endotoxin shock model and colitis model; 图1c-e |
| 细胞培养和刺激 | 细胞类型（腹腔巨噬细胞、BMDM、BMDC）、刺激物（LPS、poly(I:C)、VSV、HSV-1）、刺激时间（如4小时） 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and RNA interference; 图2b-e |
| siRNA敲低 | siRNA靶序列和来源（Dharmacon M-065655-01 for Kdm2b siRNA-1, Santa Cruz sc-75006 for Kdm2b siRNA-2）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、敲低效率验证 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and RNA interference; 图2c |
| ChIP和Re-ChIP | 抗体（KDM2B NBP2-14954, Brg1 ab110641, RNA Pol II）、交联时间（10分钟）、甲醛浓度（1%）、检测的启动子区域（Il6、Tnf、Ifnb1） 阅读提示：Materials and methods, Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and Re-ChIP assays; 图3a-c, 图5e-f, 图6b |
| 染色质可及性分析 | DNase I浓度（0.1 U/μl）、消化时间（30分钟）、FAIRE实验的甲醛交联和超声条件 阅读提示：Materials and methods, DNase I sensitivity analysis and FAIRE assay; 图4 |