类器官样本染色方法

方法一：OCT冷冻包埋及免疫荧光染色步骤

1、弃去类器官培养基，在室温下用 1 mL 1XPBS 清洗每个孔内残留培养基，弃去上清；

2、在室温下，配制2%多聚甲醛(PFA)+0.1%戊二醛(GA)(由1XPBS制备)来固定类器官-基质胶圆顶结构，时间为1 h；

注：PFA会导致基质胶的解聚，戊二醛的添加解决了这个问题，但是戊二醛的自发荧光较高，因此每个方案中的淬灭步骤都必须优化（见文后类器官自发光荧光猝灭方法）。

3、用1 mL 1XPBS 清洗3次，每次10分钟，以去除固定液；

4、用勺子或刮刀小心地刮下类器官-基质胶圆顶结构，将其置于含有20%蔗糖溶液(由 1XPBS 制备) 的50 mL离心管中，并在 2~8℃下放置过夜或直至圆顶结构沉入管底；

5、从蔗糖溶液中捞取出圆顶结构，将其置于含OCT化合物的包埋模具中。每块包埋多个同一批次的类器官-基质胶圆顶结构。快速冷冻，并保存在-80℃ 以下，保存不要太久，尽量不超过一周；

6、使用冷冻切片机进行类器官冷冻切片。关于类器官冷冻切片的厚度，建议为8-10 μm；

7、用 1XPBS 清洗3 次，每次10 min，在室温下用 3% BSA的PBS溶液（封闭液）封闭玻片；

8、一抗孵育：用封闭液将一抗稀释至所需的终浓度，在类器官上加入适量一抗，将玻片放入加湿盒内，在2~8℃下孵育过夜；

9、二抗孵育：用 1XPBS 清洗3次，每次10 min，用封闭液将二抗稀释至所需的终浓度。在类器官上加入适量二抗。在室温下孵育 1.5~2 h；

10、DAPI避光孵育15 min，PBS洗3次，每次2 min；

11、用甘油或抗荧光淬灭液进行封片，于荧光显微镜或共聚焦显微镜下进行图像采集。

类器官自发光荧光猝灭方法：

1、用1XPBS清洗玻片15 s，以去除OCT；

2、在室温下将玻片放入10 mM NaBH4溶液(由1XPBS制备)中孵育两次，每次5 min，淬灭固定步骤后产生的醛基。如果检测到自发荧光，可延长淬灭时间；

注：淬灭样品时也可以使用0.2 M甘氨酸溶液(由1XPBS制备)来孵育两次，每次孵育15 min；

3、用1XPBS清洗3次，每次10 min。

方法二：整体法免疫荧光染色

1、弃去类器官培养基，在室温下用 1 mL 1XPBS， 清洗孔板的每个孔，轻柔吹打基质胶，将类器官从基质胶中解离出来；

2、固定：4% 多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次2 min；

3、透化：0.5% Triton透膜20 min，PBS洗3次，每次2 min；(如果需检测的目的蛋白属于胞内蛋白或者抗原抗体结合位点位于胞内的跨膜蛋白，在抗体孵育前需进行透膜处理)

4、封闭：1% BSA室温封闭60 min，PBS洗3次，每次2 min；

5、一抗孵育：5% BSA稀释的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次2 min；

6、二抗孵育：5% BSA稀释的二抗，室温避光孵育1 h，PBS洗3次，每次2 min；

7、DAPI避光孵育15 min，PBS洗3次，每次2 min；

8、图像采集:将离心管内的类器官用润洗后的枪头轻柔的转移至共聚焦培养板中，于激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察拍照。

方法三：类器官石蜡切片染色

类器官收集：

1、取出类器官培养板，镜下观察类器官大小，待类器官培养到直径100~200 μm大小，即可进行类器官石蜡包埋;

2、使用移液枪吸去培养液，加入等体积的预冷基础培养基，使用润洗后的枪头(剪去尖端)轻轻划破或吹散基质胶和类器官的混合培养物，转移至1.5 mL离心管中，轻柔吹打几次，冰上静置5 min；

3、200~300 g，4℃，离心5 min后，可见培养基、基质胶和类器官沉淀从上至下分三层。如果基质胶去除不干净，可再次用基础培养基重悬类器官离心后弃上清直至基质胶去除干净。

类器官固定:

1、将1 mL 4% 多聚甲醛加入类器官沉淀中，轻柔吹打使其混匀，后于冰上或4℃静置固定1 h，固定结束后，200~300 g，4℃，离心5 min弃去上清；

2、加入1 mL PBS重悬类器官，200~300 g，4℃，离心5 min弃去上清。

琼脂糖包埋：

1、称量0.2至0.4 g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内，加入10 ml左右PBS。微波炉高火融化，每隔5 s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全；

2、待琼脂糖溶液降温至50-60℃，取30~50 μl融化琼脂糖溶液，使用润洗后的枪头(剪去尖端)加入至1.5 ml EP管重悬类器官沉淀，冰上放30 min，待其凝固。

类器官石蜡包埋

1、脱水：剪去离心管底部小心取出琼脂糖块放入包埋盒中，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%和95%乙醇各1 h，100%乙醇30 min，待其凝固；

2、融蜡：提前4 h左右打开烘箱，65℃溶蜡；

3、透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中（二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中），将包埋盒转移至二甲苯中5 min处理两次；
注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯；

4、浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2 h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2 h；

5、包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具；

6、切片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般是5-8um厚，并用小镊子将包含有完整组织的切片置于40°C温水中；

7、每种组织用载玻片捞5-6张片子每张载玻片上捞两份，将捞好的片子于显微镜下观察类器官是否切到、完整等；

8、挑出比较好的切片于65℃的烤片机上进行烤片30 min。

类器官HE染色：

1、脱蜡水化：依次将切片放入二甲苯Ⅰ10 min；二甲苯Ⅱ10 min中进行脱蜡；然后依次放入无水乙醇Ⅰ5 min；无水乙醇Ⅱ5 min；95%酒精5 min；90%酒精5 min；80%酒精5 min；70%酒精5 min；蒸馏水洗；

2、苏木素染细胞核：切片放入Harris苏木素染3-8 min，自来水洗；

3、伊红染细胞质：切片放入伊红染液中染色1-3 min，自来水洗；

4、脱水封片：将切片依次放入95%酒精I 5 min；95%酒精II 5 min；无水乙醇Ⅰ5 min；无水乙醇Ⅱ5 min ；二甲苯Ⅰ5 min；二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

5、显微镜镜检，图像采集分析。

附带详细染色方法，需要pdf密码请联系17714680518（微信同号）