人CIK细胞培养方案

人CIK细胞培养方案

外周血单个核细胞的采集
1.用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100ml;
2.淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC);
3.无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。

CIK细胞的培养及鉴定
1.将PBMC按1-2x105/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 p/ml的重组人IFN-Y,37°C，5%C0,培养箱中培养;
2.24h后加入50 ng/ml的CD3单克隆抗体和300p/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖;
注:此时也可同时加入100 p/ml的重组人IL-14。
3.每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2300p/ml;
4.在培养的第14d，收获CIK细胞。
5.CIK细胞质控:
  5.1台盼蓝染色检测:活细胞应在80%以上;
  5.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达:CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
  5.3细胞杀伤实验:以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200，设3个复孔。培养4h，然后取培养上     清，用乳酸脱酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
  5.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准:病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。

细胞培养所需细胞因子及抗体:

细胞鉴定所需抗体:

参考文献:
[1] LiR, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lungcancer: a phase ll clinical study. Cancer lmmunol lmmunother. 2012:61:2125-2133